Summary

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

Abstract

המבנה של רקמת המעי מאפשר אינטראקציות קרובות והדדיות בין הפונדקאי למיקרוביוטה במעיים. שיחות צולבות אלה חיוניות לשמירה על הומאוסטזיס מקומי ומערכתי; שינויים בהרכב המיקרוביוטה במעיים (דיסביוזיס) מקשרים למגוון רחב של מחלות אנושיות. שיטות לנתח אינטראקציות בין מארח למיקרוביוטה מקיפות החלפה אינהרנטית בין שימור מבנה הרקמה הפיזיולוגית (בעת שימוש במודלים של בעלי חיים של vivo) לבין רמת השליטה על גורמי הניסוי (כמו במערכות פשוטות בתרבית תאי חוץ גופיה). כדי לטפל בהחלפה זו, Yissachar ואח ‘ פיתחו לאחרונה מערכת תרבית איברי מעיים. המערכת משמרת בניית רקמת המעי הגס הנאיבית ומנגנונים תאיים והיא גם מאפשרת שליטה ניסיונית הדוקה, ומאפשרת ניסויים שלא ניתן לבצע בקלות ב- vivo. זה אופטימלי לנתח תגובות לטווח קצר של רכיבי מעיים שונים (כגון אפיתל, אלמנטים אימונולוגיים ונוירולוגיים) כדי הפרעות זוהר (כולל חיידקים אנאירוביים או אירוביים, דגימות מיקרוביוטה שלמות מעכברים או בני אדם, תרופות ומטבוליטים). כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול ממוטב לתרבות איברים של שברי מעיים מרובים באמצעות מכשיר תרבות מעיים מותאם אישית. תגובות מארחות להפרעות זוהרות יכולות להיות חזותיות על ידי כתמים אימונופלואורסצנטיים של מקטעי רקמות או שברי רקמות של הר שלם, הכלאה פלואורסצנטית במקום (FISH), או הדמיה לשגות זמן. מערכת זו תומכת במגוון רחב של קריאות, כולל רצף הדור הבא, ציטומטריית זרימה וביקורים תאיים וביוכימיים שונים. בסך הכל, מערכת תרבית איברים תלת ממדית זו תומכת בתרבות של רקמות מעיים גדולות ושלמות ויש לה יישומים רחבים לניתוח ברזולוציה גבוהה והדמיה של אינטראקציות בין מארח למיקרוביוטה בסביבת המעיים המקומית.

Introduction

המעי הוא איבר מורכב ביותר המכיל מגוון רחב של סוגי תאים (תאי אפיתל, תאי מערכת החיסון, נוירונים ועוד) המאורגן במבנה מסוים המאפשר לתאים לקיים אינטראקציה ולתקשר זה עם זה ועם התוכן הלומינלי (מיקרוביוטה, מזון וכו ‘). 1.נכון לעכשיו, ארגז הכלים המחקרי הזמין לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה כולל תרביות תאים במבחנה ומודלים של בעלי חיים ב- vivo 2. מודלים של בעלי חיים ב-Vivo מספקים בניית רקמות פיזיולוגיות3, אך עם שליטה ניסיונית לקויה ויכולת מוגבלת לתפעל את תנאי הניסוי. במערכות תרבית במבחנה, לעומת זאת, להשתמש בתאים ראשוניים או קווי תאים שניתן להשלים עם חיידקים4, המציע שליטה הדוקה על הפרמטרים הניסוי אבל חסר את המורכבות התאית ואת ארכיטקטורת הרקמות. בדיקות במבחנה מודרניות מאפשרות שימוש מתקדם בדגימות רקמה אנושית בריאה ופתולוגית, כמו אורגנוידים אפיתל שמקורם בעכבר או ממקורות אנושיים5,6, ודגימות המחקות את המיקרו-סביבה הרירית7. דוגמה נוספת היא “המעיים על שבב” assay, הכולל את קו התא אפיתל המעי הגס האנושי (Caco2), מטריצה חוץ תאית וערוצים microfluidic לחקות את המצב הפיזיולוגי של invariantהמעיים 8. עם זאת, מתקדם וחדשני כמו דגימות במבחנה עשוי להיות, הם אינם שומרים על ארכיטקטורת רקמות נורמלית או הרכב תאי נאיבי.

כדי להתמודד עם זה, Yissachar ואח ‘ פיתחו לאחרונה מערכת תרבות איברים ex vivo 9 (איור 1) השומרת על שברי מעיים שלמים ex vivo,נהנה מהיתרונות של הן ב- vivo והן במודלים במבחנה. מערכת זו של תרבית איברי המעיים ex vivo מבוססת על התקן תרבות מותאם אישית התומך בתרבית מולטיפלקסים של שש רקמות המעי הגס, ומאפשר לבחון תשומות ניסיוניות בתנאים דומים תוך שליטה על התשומות והתפוקות של המערכת. עבודות אחרונות הוכיחו כי מערכת זו היא בעלת ערך לניתוח תגובות מעיים לחיידקי מעיים בודדים 9 ,דגימותמיקרוביוטה אנושיות שלמות10 ומטבוליטים מיקרוביאליים11. מערכת זו מאפשרת, לראשונה, לחקור את האינטראקציות המוקדמות בין המארח למיקרוביוטה עם רמה גבוהה של שליטה על הרכיבים המארחים, המיקרוביאליים והסביבתיים. יתר על כן, הוא מאפשר ניטור ומניפולציה של המערכת לאורך כל הניסוי, בזמן אמת.

Figure 1
איור 1: שרטוטים של מכשיר תרבות המעיים. שבר רקמת מעיים שלם מחובר ליציאות היציאה והקלט של התא (למעלה), עם משאבות המסדירות את הזרימה הבינונית בתוך הלומן ובתא הבינוני החיצוני. המכשיר כולו (התחתון) מכיל 6 תאים כאלה. נתון זה שונה מישאר ואח’ 2017. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

פרוטוקול זה תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי החיים. 1. הכנת ניסוי ייצור של מכשיר תרבות איברי המעיים (3 ימים) באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את תבניות הפלסטיק הניתנות לשימוש חוזר עבור התקן תרבות האיברים (להתקן יש 6 בארות, עם 24 חורים קט?…

Representative Results

מערכת תרבית איברי המעיים שומרת על כדאיות רקמות ex vivo. הערכת הכדאיות של הרקמה נעשתה לאורך כל תקופת התרבות. שברי רקמת המעי הגס דוגרו במערכת תרבית איברי המעיים ותוקנו בעקבות תרבית 2/12/24 h. שלמות שכבת תאי האפיתל במעיים (IEC) אומתה על ידי כתמי אימונופלואורסצנטיות באמצעות נוגדנים E-cadherin ו- ציטוק?…

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב לתרבויות איברי המעיים ex vivo כי Yissachar ואח ‘ פיתחו לאחרונה(פורסם 9 נתונים שלא פורסמו). מערכת תרבית איברי המעיים תומכת בתרבית מולטיפלקסים של שברי מעיים שלמים תוך שמירה על זרימה זוהרת. הוא מספק שליטה מלאה על הסביבה הפנים-אור-זוהרת (כולל מינון גירוי, זמ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מעבדת יששכר בעבר ובהווה על תרומתם החשובה באופטימיזציה של פרוטוקול מערכת תרבות איברי הבטן. אנו מודים ליעל לור על העריכה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הישראלית למדע (מענק מס’ 3114831), הקרן הישראלית למדע – תכנית משותפת של מכון רחב (מענק מס’ 8165162) וקרן גאסנר למחקר רפואי.

Materials

Device
18 Gauge Blunt Needle Mcmaster 75165a754
22 Gauge Blunt Needle Mcmaster 75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone DAP 688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick Corning 2947-75X50
Mini Incubator im-10 AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs Mcmaster 51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets Mcmaster 52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing Mcmaster 6516t11
Zortrax M200 Zortrax Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free Thermo Fisher Scientific 17504044
HEPES Buffer (1M) Thermo Fisher Scientific 15630056
Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) Thermo Fisher Scientific 12440061
Knock-Out Serum Thermo Fisher Scientific 10828028
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific A1370701
Non Essential Amino Acid (100x) Thermo Fisher Scientific 11140035
Surgical Tools
Large Scissors Aseltech 11-00-10
Sharp Forceps F.S.T 11297-10
Silk Braided Surgical Thread SMI 8010G
Straight Scissors F.S.T 14091-09
Thin Forceps F.S.T 11051-10
Organ System
0.1 µm Filter Life Gene
0.22 µm Filter Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe B-D 309649
Greenough Stereo Microscope ZEISS Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE" CUBE-2-LIS
Syringe Pump new era pump systems inc nep-ne-1600-em

References

  1. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  2. Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
  3. Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
  4. Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  7. Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
  8. Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
  9. Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
  10. Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
  11. Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
  12. Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  13. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  14. Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
  15. Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
  16. Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).

Play Video

Cite This Article
Azriel, S., Bootz, H., Shemesh, A., Amidror, S., Yissachar, N. An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions. J. Vis. Exp. (172), e62779, doi:10.3791/62779 (2021).

View Video