이 프로토콜은 적극적으로 수축심장 trabecula ex vivo에서sarcomere, 칼슘 및 거시적 기하학적 기하학적 데이터의 컬렉션을 제공합니다. 이러한 동시 측정은 세 가지 이미징 양식의 통합에 의해 가능하게됩니다.
심장 근육에서, 세포 내 Ca2+ 과도는 수축 근막을 활성화, 수축을 일으키는, 거시적 단축, 기하학적 변형. 우리는 근육 내부의 ‘볼’도 정확하게 흥분 수축 역학의 현시적 특성을 추적 할 수 없기 때문에 이러한 이벤트 사이의 내부 관계에 대한 우리의 이해는 제한되었습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 이미징 양식 제품군을 결합한 장치를 구축했습니다. 특히, 그것은 sarcomere 길이와 조직 긴장의 국소 변화를 측정하기 위해 밝은 필드 현미경을 통합, Ca2 + 과도를 시각화하는 형광 현미경, 심장 사이클의 시간 과정을 통해 조직의 기하학적 변화를 캡처하는 광학 일관성 토모그래프. 이미징 인프라 및 관련 데이터 수집 프레임워크를 소개합니다. 데이터는 trabeculae 카네아로 알려진 고립 된 막대 같은 조직 구조에서 수집됩니다. 우리의 악기에서, 위치 제어 백금 후크 한 쌍은 지속적으로 영양이 풍부한 식염수 용액으로 슈퍼파이드하는 동안 전 생체 근육 샘플의 각 끝을 보유합니다. 후크는 독립적 인 통제하에 있으며 근육 길이와 힘의 실시간 제어를 허용합니다. 세로로 변환하면 시료를 조각적으로 스캔할 수 있으며, 현미경 이미징 창(540 μm x 540μm)과 일반적인 트라베큘라(>200 μm)의 길이와 관련된 상대적 크기와 관련된 한계를 극복합니다. 근육 실의 양쪽 끝에 있는 백금 전극은 사용자 정의 속도로 trabecula를 자극한다. 각 이미징 창에서 데이터를 동기화하여 정상 상태 조건에서 전체 샘플 경련을 재구성하기 위한 트리거로 자극 신호를 활용합니다. 이러한 브라이트필드 이미징 데이터에 이미지 처리 기술을 적용하면 조직 변위와 사컴 길이 맵이 제공됩니다. 이러한 데이터 수집은 실험 모델링 파이프라인에 통합될 때 생리학 및 병리학분야에서 근육 수축 균질성 및 이질성에 대한 심층적인 이해를 제공할 것입니다.
격리된 심장 근육 조직 제제의 과융합은 심장 이온 활성화 및 역학1을공부하기 위한 표준적이고 널리 사용되는 프로토콜이다. 특히, 심실 벽으로부터 의 석영, 막대형 구조물의 분리는 수축2의길이 의존적 활성화, 수축3,4,및 심장 조직의 확장기 점성 탄성5의 스트레치 의존적 반응을 포함하는 현상의 평가를 가능하게 하였다. Ter Keurs, 고립 된 trabeculae를 초첩하는이 기술의 이 기술의 시공자, 처음에 사코메 길이 를 결정하기위한 Ca2 + 측정 및 레이저 회절에 대한 형광 이미징의 조합을 사용2,5. 이러한 초기 연구 이후, 브라이트 필드 현미경이미지에 2D 빠른 Fourier 변환 (FFT) 기반 기술을 사용하여 더 큰 공간 해상도와 사코레 길이 정보를 추출하는 것이 점점 더 일반화되고있다. 두 이미징 시스템은 Ca2+ 릴리스와 sarcomere 길이 종속 력 생산 사이의 근본적인 관계에 대한 부분적인 평가를 허용합니다.
심장 근육은 두껍고 두꺼운 필라멘트로 구성된 수축 단위의 기본 시리즈와 관련된 눈에 보이는 밴딩으로, striated. sarcomeres를 구성하는 이러한 구성 필라멘트의 상호 작용은 다음과 같이 시작되는 힘 생성의 근간을 나타냅니다: 탈극화 전기 신호, 또는 작용 잠재력은 세포막에 있는 전압 의존형 L형 Ca2+ 채널을 열어 놓습니다; Ca2+의 후속 세포 유입은 Ca2+ -유도된 Ca 2+ 릴리스7로알려진 프로세스에서 세포내 Ca2+ 저장소인 사코플라즈마 망상(SR)으로부터 Ca2+의방출을 유도합니다. 나노 몰러에서 마이크로 몰라 범위에 세포 내 Ca2+ 농도의 이 급격한 증가는 힘 생산이 발생할 수 있습니다; Ca2+ 펌프는 지속적으로 SR 및 세포 외 구획으로 다시 사이토솔에서 Ca2 + 를 돌출; 세포 내 Ca2+ 농도가 나노 몰라 범위로 돌아오면 강제 생산이 중단되고 근육이 이완됩니다. 강제 생산 중에 구성 성분이 두껍고 얇은 필라멘트가 서로 미끄러져 나아있습니다. 사코머 길이는 겹치는 상대적 정도를 지시하므로 근육의 강제 생산 가능성은 거시적으로 결정됩니다.
이 논문에서, 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 포함하는 이 형광-밝은 필드 화상 진찰 기술을 확장합니다. OCT는 간섭의 물리적 원리를 이용하고 근육 수축 이질성을 이해하기 위하여 조직의 기하학적 변형을 얻을 수 있습니다8. 우리의 장치(그림 1)스펙트럼 도메인 OCT (SD-OCT) 시스템을 사용합니다. SD-OCT에서 빔 스플리터는 광대역 짧은 응고 길이초발광 다이오드에서 빛을 참조 및 측정 암으로 분할합니다. 기준 암에는 고정 거울이 포함되어 있으며 측정 팔에는 빛을 조종하는 2D 갈바노미터가 포함되어 있습니다. 샘플에서 백산된 빛이 수집되고 참조 암에 반사된 빛을 방해하여 간섭 패턴을 형성합니다. 깊이 정보는 스펙트럼 프린지의 주파수로 인코딩됩니다. 정보를 추출하기 위해 신호는 분광계를 통과하고 역 FFT가 결과에 적용됩니다. 해당 1D 신호는 굴절률 9(A-스캔)의 변화에 대응하는 서로 다른 깊이의 구조를 나타냅니다. 레이저를 단일 축으로 조향함으로써, 하나는 관심 있는 시료(B-scan)의 단면을 구성할 수 있으며, 마찬가지로, 남은 축에서 단계별 패턴으로 공정을 반복함으로써, 3차원 영상을 생성할 수 있다(C-s스캔). 확장하여, 외부 트리거를 기반으로 반복 시간 변화 피사체에 대한 단일 슬라이스에서 일련의 B 스캔을 수집하고 시간 변화 평면이미지(10)를나타내는 3차원 스캔을 생성하기 위해 반복할 수 있다.
3개의 화상 진찰 시스템을 통합에서, 우리는 다음 두 가지 원리를 고려했습니다. 첫째, 이미징 센서는 대체 이미징 양식에서 빛을 감지해서는 안되며, 둘째, 물리적 설계에는 적어도 3개의 동시 이미징 평면에 대한 여유 공간이 포함되어야 합니다. 첫 번째 요구 사항을 해결하기 위해 밝은 필드 현미경은 660 nm 파장 LED를 사용하여 반전 된 구성으로 샘플을 조명합니다. 형광 현미경은 동일한 객관적인 렌즈가 방출된 빛의 여기 및 수집을 위해 사용되는 상피 성화 구성에 있습니다. 흥분광은 340nm에서 380nm 사이의 파장을 가지며, 광증 튜브(PMT)는 510nm의 파장에서 방출된 빛을 측정한다. 한 쌍의 이색 거울을 사용하면 반대측정(그림 2)을방해하지 않고 이 두 개의 광학 경로를 동일한 물리적 발자국을 공유할 수 있습니다. 마지막으로 OCT는 광대역(100nm 스펙트럼 폭) 라이트를 사용하여 중앙 파장이 840nm로 다른 두 양식과 구별됩니다. OCT에 사용되는 빛의 낮은 일관성 특성으로 인해 밝은 필드 형광 원에서 산란 된 빛은 깊이 정보를 인코딩하는 간섭 패턴에 기여하지 않습니다. 두 번째 요구 사항에 대해, 모세관 튜브에 대한 하우징 디자인은 샘플의 전방, 열등, 우수한 평면에 접근 광학 경로를 가지고있다. 실험 중, 두 개의 백금 후크는 산소 크렙스 헨셀레이트 (KH) 용액으로 인하여 모세관 튜브 내에서 trabecula를 개최합니다. OCT의 갈바노미터 헤드는 제3직기 광학평면(그림 3)을활용하기 위해 밝은 필드 형광 이미징 경로에 직교를 지향한다.
이 논문은 칼슘, 사코메 길이 및 근육 기하학을 동시에 이미징할 수 있는 장치를 구축하기 위한 설계 고려 사항을 설명합니다. 이러한 측정 기능을 입증하기 위해, 당사는 전 생체 내 trabecula의 처리 및 형광 로딩과 관련된 중요한 단계와 함께 심실 trabecula, 필요한 완충 솔루션의 제조를 격리하는 과정을 설명합니다. 마지막으로 이 백서는 데이터 집합을 보다 유용한 시각화로 변환하는 데 필요한 프로세스를 간략하게 설명합니다.
본 연구에서는, 브라이트필드, 형광, OCT 이미징을 결합한 3개의 광학 시스템의 조립이 능동적으로 수축된 전 생체 내 심장 트라베큘라(도1 및 도 2)로부터데이터를 수집할 수 있는 구성을 제시한다. 이러한 오케스트레이션된 통합은 10월의 직교 배열을 능장 형광축으로 가능하게 하기 때문에 측정챔버(도 3)의설계로 인해 가능하다. 근육 장착 시스템은 심장 근육 흥분 수축 역학을 특성화하는 주요 지수의 동시 정량화의 성공에 동등하게 중요한 역할을한다. 그 참신은 근육의 기계적 성능에 명백한 방해없이 근육 스캐닝 절차를 가능하게에 상주(그림 6). 힘 측정을 위한 이미징 구성 및 동력 후크 시스템을 결합한 이 시스템은 Twitch의 시간 과정 전반에 걸쳐 수축 trabecula의 거시적 기하학적 정보와 함께 Ca2+ 과도, 변위 및 사코메르 길이의 지역 이질성을 평가할 수있습니다(그림 7 및 도 8).
심장 연구 실험실 내의 밝은 필드 과민성 이미징 시스템의 보편성을 감안할 때, 이러한 결과의 재생은 몇 가지 사소한 하드웨어 고려 사항으로 달성 될 수있다. 여기서는 기본 수축 이질성을 분석하는 데 필수적인 브라이트필드-에피플루오시스와 OCT를 결합하기 위한 이미지 처리 툴킷을 소개합니다. OCT의 통합은 방해받지 않는 광학 경로를 필요로 하며, 게이트 이미징은 자극과 OCT 및 브라이트필드 이미징 카메라, 측정 챔버 전체에서 시료를 이동할 수 있는 근육 장착 후크 사이의 외부 트리거 라인을 필요로 합니다. 필요한 후처리 소프트웨어 및 방법을 자유롭게 사용할 수 있습니다. 특히, 사용되는 세분화 소프트웨어, WEKA14,오픈 소스입니다. 재료 점8,사코메 길이, 게이트 볼륨이미징(10)및 메쉬 생성 코드의 마커리스 추적 기술은 마찬가지로 접근 가능하며 해당 저자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
근육 생존가능성, 후라-2의 최적의 로딩, 이미지 포커스는 성공적인 실험의 기초를 형성하는 세 가지 기둥입니다. BDM을 함유한 해부 용액을 사용하여 수축, 주사기에서 근육 의 수송, 용액의 지속적인 산소화, 실험 당일에 새로운 실험 용액을 준비하는 등 모두 높은 근육 생존율에 기여한다. 후라-2AM으로 trabecula를 로드하기 전에, 자동 불발은 측정 된 Ca2 + 과도15에상당한 영향을 미칠 수 있으므로 공부에 관심이각 조건에 대해 수집해야합니다. 후라-2AM 로딩 용하액의 산소화는 염료 하중을 돕기 위해 계면활성제 황색-F127을 필요에 포함시킴으로써 복잡하다. 이러한 계면활성제에 의한 과도한 버블 형성에 대처하기 위해, 로딩 용액에서 약간의 항폼 방울을 통해 사용자는 산소화 속도를 증가시킬 수 있으므로, 이로써 trabecula가 로딩 공정 전반에 걸쳐 기능적 생존력을 유지할 가능성을 향상시킵니다. 마지막으로, 이미징 포커스는 밝은 필드 및 형광 정보의 소음 비율에 대한 신호를 최대화하기 위해 근육 길이를 따라 균일해야합니다.
여기에 제시된 방법을 고려해야 할 두 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째는 형광 현미경의 공간 해상도입니다. OCT 및 브라이트필드 이미징의 공간 해상도는 높지만 형광 현미경의 해상도는 540 μm 내에 포획된 부피로부터 형광의 일체로 제한되며 540 μm x 540 μm 이미징 창. PMT 대신 고이득 충전 결합 장치 카메라를 사용하여 형광 현미경의 공간 해상도를 증가시켜 신호 대 잡음비(16)를희생하여 형광 신호를 캡처할 수 있는 범위가 있다. 두 번째는 측정 가능한 sarcomere 길이와 기하학적 깊이의 관점에서 연구 할 수있는 trabecula의 직경입니다. sarcomere 길이를 계산하기 위한 창-FFT 접근 방식은 향상된 공간 해상도의 이점을 활용하지만 향상된 견고성(그림8D)과관련이 있습니다. 혼탁또는 직경이 큰 trabeculae를 연구해야 하는 경우, 더 큰 조직 샘플에서 육종 밴딩과 관련된 감소된 대비로 인해 FFT의 재발성이 크게 감소될 것이다. 마찬가지로, 10월 내에서 300μm 이상의 이미징 깊이에서 반사가 너무 약하여 세분화 단계에서 해결될 수 있습니다. 따라서, 우리의 기술은 300 μm 미만 직경의 trabeculae로 제한됩니다. 그러나, 자극의 높은 속도 동안 근육 코어의 확산 산소화에 문제가있을 수 있으므로 큰 직경 샘플을 연구하는 것이 좋습니다17.
우리의 방법은 건강하고 병들인 근육에 있는 근육 기하학과 관련있는 이온 기계 기능의 평가를 가능하게 합니다, 심장 근육 생리학, 병리생리학 및 약리학을 이해하는 강력한 접근을 제공하는. 여기에 설명된 이미지 처리 파이프라인은 수축 이질성에 대한 심층적인 이해를 얻는 데 중추적인 데이터가 추출됩니다. 이러한 풍부한 데이터 집합의 잠재력을 완전히 실현하는 한 가지 방법은 이러한 데이터를 통합하고 해석하는 수학적 모델을 구성하고 장치를 사용하여 실험적으로 테스트할 수 있는 예측을 하는 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 뉴질랜드 건강 연구 위원회에서 오클랜드 대학 (JD 및 MC에게 수여), 경 찰스 헤커스 건강 연구 펠로우십 (20/011 및 21/116)에서 박사 장학금에 의해 투자되었다 (KT에 J-CH에 수여, 각각 국립심장재단(AA 수여) 박사장학금, 뉴질랜드 왕립학회(J-CH, KT에 수여) 마스덴 패스트스타트 보조금(UOA1504, UOA1703) 각각) 뉴질랜드 왕립 학회에서 제임스 쿡 연구 펠로우십 (AT에 수여). 이 악기의 원래 개발은 뉴질랜드 왕립 학회 (AT와 PN에 수여)에서 마스덴 보조금 (11-UOA-199)에 의해 투자되었다.
2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
Heparin | Pfizer | 61024 | |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
Matlab | Mathworks | Data processing code | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
Powerload | Thermofisher | P10020 | |
Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
Transimpedance amplifier | Custom | ||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |