Dit protocol presenteert een verzameling sarcomere, calcium en macroscopische geometrische gegevens van een actief samentrekkende cardiale trabecula ex vivo. Deze gelijktijdige metingen worden mogelijk gemaakt door de integratie van drie beeldvormende modaliteiten.
In hartspier activeren intracellulaire Ca2+ transiënten contractiele myofilamenten, wat contractie, macroscopische verkorting en geometrische vervorming veroorzaakt. Ons begrip van de interne relaties tussen deze gebeurtenissen is beperkt omdat we niet in de spier kunnen ‘zien’ noch precies de spatio-temporele aard van excitatie-contractiedynamiek kunnen volgen. Om deze problemen op te lossen, hebben we een apparaat gebouwd dat een reeks beeldverwerkingsmodaliteiten combineert. In het bijzonder integreert het een brightfield-microscoop om lokale veranderingen van sarcomerelengte en weefselspanning te meten, een fluorescentiemicroscoop om de Ca2 + transiënte te visualiseren en een optische coherentietomografie om de geometrische veranderingen van het weefsel tijdens de loop van een hartcyclus vast te leggen. We presenteren hier de beeldvormingsinfrastructuur en het bijbehorende framework voor gegevensverzameling. Gegevens worden verzameld uit geïsoleerde staafachtige weefselstructuren die bekend staan als trabeculae carneae. In ons instrument houden een paar positiegestuurde platinahaken elk uiteinde van een ex vivo spiermonster vast terwijl het continu wordt oversmolten met een voedingsrijke zoutoplossing. De haken staan onder onafhankelijke controle, waardoor real-time controle van spierlengte en kracht mogelijk is. In de lengte kan het monster in de lengte worden gescand, waardoor beperkingen in verband met de relatieve grootte van het microscoopbeeldvenster (540 μm bij 540 μm) en de lengte van een typische trabecula (>2000 μm) worden overschreden. Platinaelektroden aan beide uiteinden van de spierkamer stimuleren de trabecula met een door de gebruiker gedefinieerde snelheid. We gebruiken het stimulatiesignaal als trigger voor het synchroniseren van de gegevens uit elk beeldvenster om het hele monster te reconstrueren dat onder steady-state omstandigheden trilt. Het toepassen van beeldverwerkingstechnieken op deze brightfield beeldvormingsgegevens zorgt voor weefselverplaatsing en sarcomere lengtekaarten. Een dergelijke verzameling van gegevens, wanneer opgenomen in een experiment-modellering pijpleiding, zal een dieper begrip van spier contractiele homogeniteit en heterogeniteit in fysiologie en pathofysiologie.
Superfusie van geïsoleerde hartspierweefselpreparaten is een standaard en veel gebruikt protocol voor het bestuderen van cardiale ionische activering enmechanica 1. In het bijzonder heeft de isolatie van trabeculae, staafachtige structuren van de ventriculaire wanden, de beoordeling mogelijk gemaakt van verschijnselen, waaronder de lengteafhankelijke activering van contractie2,rekafhankelijke respons van contractie3,4en diastolische visco-elasticiteit5 van hartweefsel. Ter Keurs, de initiatiefnemer van deze techniek van het superfusing van geïsoleerde trabeculae, gebruikte aanvankelijk een combinatie van fluorescentiebeeldvorming voor Ca2+ metingen en laserdiffractie voor het bepalen van sarcomerelengtes2,5. Sinds deze vroege studies is het steeds gebruikelijker geworden om sarcomere lengte-informatie met een grotere ruimtelijke resolutie te extraheren met behulp van 2D fast Fourier transform (FFT)-gebaseerde technieken6 op brightfield microscopiebeelden. De twee beeldvormingssystemen maken een gedeeltelijke beoordeling mogelijk van de onderliggende relatie tussen Ca2+ afgifte en sarcomere lengte-afhankelijke krachtproductie.
Hartspier is geried, met de zichtbare banderolleren geassocieerd met een onderliggende reeks contractiele eenheden bestaande uit dikke en dikke filamenten. De interactie van deze samenstellende filamenten waaruit sarcoom bestaat, ligt ten grondslag aan krachtgeneratie, die als volgt begint: een depolariserend elektrisch signaal, of actiepotentieel, zorgt ervoor dat spanningsafhankelijke L-type Ca2+ kanalen in het celmembraan openen; de daaropvolgende cellulaire instroom van Ca2+ induceert de afgifte van Ca2+ uit het sarcoplasmatisch reticulum (SR), een intracellulaire Ca2+ opslag, in een proces dat bekend staat als Ca2+-geïnduceerde Ca2+ afgifte7; deze plotselinge toename van de intracellulaire Ca2+ concentratie van nanomoulier tot micromolar bereik maakt krachtproductie mogelijk; Ca2+ pompen extruderen ca2+ continu uit de cytosol terug in het SR- en extracellulaire compartiment; wanneer de intracellulaire Ca2+ concentratie terugkeert naar het nanomolarenwaaier, stopt de krachtproductie en ontspant de spier. Tijdens de krachtproductie glijden de dikke en dunne filamenten over elkaar heen. De sarcoomlengte bepaalt de relatieve mate van overlap en dus het potentieel voor krachtproductie van de spier macroscopisch.
In dit artikel breiden we deze fluorescentie-brightfield beeldvormingstechnieken uit met optische coherentietomografie (OCT). OCT maakt gebruik van het fysische principe van interferentie en is in staat om de geometrische vervorming van weefsel te verkrijgen om spiercontractiele heterogeniteit te begrijpen8. Ons apparaat (figuur 1) maakt gebruik van een spectral-domein OCT (SD-OCT) systeem. In SD-OCT splitst een bundelsplijter het licht van een breedband superluminescente diode van korte coherentielengte in referentie- en meetarmen. De referentiearm bevat een vaste spiegel en de meetarm bevat een 2D-galvanometer om het licht te sturen. Het licht dat uit het monster wordt teruggekaatst, wordt verzameld en interfereert met het gereflecteerde licht in de referentiearm om een interferentiepatroon te vormen. De diepte-informatie is gecodeerd in de frequentie van de spectrale rand. Om de informatie te extraheren, wordt het signaal door een spectrometer doorgegeven en wordt een omgekeerde FFT op het resultaat toegepast. Het overeenkomstige 1D-signaal vertegenwoordigt de structuren op verschillende diepten, wat overeenkomt met veranderingen in brekingsindex9 (A-scan). Door de laser in één as te sturen, kan men een dwarsdoorsnede van het interessemonster (B-scan) construeren en op dezelfde manier, door het proces in een stapsgewijs patroon in de resterende as te herhalen, kan een driedimensionaal beeld worden gegenereerd (C-scan). Bij uitbreiding kan men een reeks B-scans verzamelen in één segment voor een herhalend tijds variërend onderwerp op basis van een externe trigger en herhalen om een driedimensionale scan te genereren, die een tijdsverlengende planaire afbeelding10vertegenwoordigt.
Bij de integratie van de drie beeldvormingssystemen hebben we de volgende twee principes overwogen. Ten eerste mogen beeldsensoren geen licht detecteren van een alternatieve beeldvormingsmodaliteit, en ten tweede moet het fysieke ontwerp vrije ruimte bevatten voor ten minste drie gelijktijdige beeldvormingsvlakken. Om aan de eerste eis te voldoen, gebruikt de brightfield-microscoop een 660 nm golflengte-LED om het monster in een omgekeerde configuratie te verlichten. De fluorescentiemicroscoop bevindt zich in een epifluorescentieconfiguratie waarbij dezelfde objectieve lens wordt gebruikt voor zowel excitatie als verzameling van het uitgestraalde licht. Het excitatielicht heeft een golflengte tussen 340 nm en 380 nm, en een fotomultiplicatorbuis (PMT) meet het uitgestraalde licht op een golflengte van 510 nm. Een paar dichroïsche spiegels stelt deze twee optische paden in staat om dezelfde fysieke voetafdruk te delen zonder de tegenovergestelde meting te verstoren (figuur 2). Ten slotte maakt de LGO gebruik van breedbandlicht (100 nm spectrale breedte) met een centrale golflengte van 840 nm, verschillend van de andere twee modaliteiten. Vanwege de lage coherentie van het licht dat voor OCT wordt gebruikt, zal strooi licht van de brightfield-fluorescentiebronnen niet bijdragen aan het interferentiepatroon dat diepte-informatie codeert. Voor de tweede vereiste heeft het behuizingsontwerp voor de capillaire buis toegankelijke optische paden naar de voorste, inferieure en superieure vlakken van het monster. Tijdens experimenten houden twee platinahaken een trabecula vast in een capillaire buis doordrenkt met zuurstofhoudende Krebs-Henseleit (KH) oplossing. De galvanometerkop van de OCT is orthogonaal gericht op de brightfield-fluorescentie beeldvormingsroute om te profiteren van het derde orthogonale optische vlak (figuur 3).
Dit artikel schetst de ontwerpoverwegingen voor het bouwen van een apparaat dat tegelijkertijd calcium, sarcomerelengte en spiergeometrie kan weergeven. Om deze meetcapaciteiten aan te tonen, beschrijven we het proces van het isoleren van een ventriculaire trabecula, de voorbereiding van de nodige bufferoplossingen, samen met de kritieke stappen die betrokken zijn bij de behandeling en fluorescentiebelasting van een ex vivo trabecula. Ten slotte schetst dit document de processen die nodig zijn om de gegevensset te vertalen naar nuttigere visualisaties.
In deze studie presenteren we een configuratie waarmee de assemblage van drie optische systemen die brightfield-, fluorescentie- en OCT-beeldvorming combineren, gegevens kan verzamelen van een actief samentrekkende ex vivo cardiale trabecula (figuur 1 en figuur 2). Een dergelijke georkestreerde integratie is mogelijk door het ontwerp van de meetkamer (figuur 3) om de orthogonale opstelling van de LGO naar de brightfield-fluorescentieas mogelijk te maken. Het spieropbouwende systeem speelt een even belangrijke rol in het succes van gelijktijdige kwantificeringen van belangrijke indices bij het karakteriseren van de dynamiek van hartspier excitatie-contractie. De nieuwigheid ervan is het mogelijk maken van spierscanprocedures zonder duidelijke verstoring van de mechanische prestaties van de spier (figuur 6). Met de gecombineerde beeldvormingsconfiguratie en het gemotoriseerde haaksysteem voor krachtmeting kan dit systeem de regionale heterogeniteit in de ca2+ transiënte, verplaatsings- en sarcomerelengte evalueren, samen met macroscopische geometrische informatie van een samentrekkende trabecula gedurende de tijd van de twitch (figuren 7 en figuur 8).
Gezien de alomtegenwoordigheid van brightfield-epifluorescentiebeeldvormingssystemen binnen hartonderzoekslaboratoria, kan de reproductie van deze resultaten worden bereikt met enkele kleine hardwareoverwegingen. Hier presenteren we de beeldverwerkingstoolkit voor het combineren van brightfield-epifluorescentie en OCT, wat essentieel is bij het analyseren van de onderliggende contractiele heterogeniteit. De integratie van de OCT vereist een onbelemmerd optisch pad, terwijl de gated imaging een externe triggerlijn vereist tussen de stimulus en zowel de OCT- als brightfield imaging camera, en spiermontagehaken die het monster door de meetkamer kunnen verplaatsen. De vereiste nabewerkingssoftware en -methoden zijn vrij beschikbaar. Met name de gebruikte segmentatiesoftware, WEKA14,is open-source. De techniek van markerless tracking van materiaalpunten8,sarcomerelengte, gated volumetrische beeldvorming10en meshgeneratiecodes zijn eveneens toegankelijk en kunnen op verzoek van de overeenkomstige auteur beschikbaar worden gesteld.
Spier levensvatbaarheid, optimale belasting van Fura-2, en beeld focus zijn de drie pijlers die de basis vormen van een succesvol experiment. Het gebruik van een dissectieoplossing met BDM om contractuur, transport van de spier in een spuit, continue oxygenatie van de oplossing en het voorbereiden van nieuwe experimentele oplossingen op de dag van een experiment te voorkomen, dragen allemaal bij aan een hoge levensvatbaarheid van de spieren. Alvorens de trabecula met Fura-2AM te laden, moet autofluorescentie worden verzameld voor elke voorwaarde die men wil bestuderen, omdat het een significant effect kan hebben op de gemeten Ca2+ transiënte15. Oxygenatie van Fura-2AM laadoplossing wordt gecompliceerd door de noodzakelijke opname van de oppervlakteactieve stof pluronic-F127 om het laden van kleurstoffen te helpen. Om de resulterende overmatige bubbelvorming veroorzaakt door deze oppervlakteactieve stof te bestrijden, stelt een kleine druppel antischuim in de laadoplossing de gebruiker in staat om de oxygenatiesnelheid te verhogen, waardoor de kans wordt vergroot dat de trabecula functionele levensvatbaarheid behoudt tijdens het laadproces. Ten slotte moet de beeldvormingsfocus gelijkmatig zijn langs de spierlengte om de signaal-ruisverhouding van de brightfield- en fluorescentie-informatie te maximaliseren.
Er zijn twee beperkingen om te overwegen met de hier gepresenteerde methoden. Ten eerste is de ruimtelijke resolutie van de fluorescentiemicroscoop. Hoewel de ruimtelijke resoluties van de OCT en brightfield imaging hoog zijn, is de resolutie van de fluorescentiemicroscoop beperkt tot de integraal van de fluorescentie van het volume dat wordt vastgelegd in een beeldvenster van 540 μm bij 540 μm. Er is ruimte om de ruimtelijke resolutie van de fluorescentiemicroscoop te verhogen door een high-gain charge-coupled apparaatcamera te gebruiken, in plaats van een PMT, om het fluorescentiesignaal vast te leggen ten koste van de signaal-ruisverhouding16. Ten tweede is de diameter van de trabecula die kan worden bestudeerd in termen van meetbare sarcomerelengte en geometrische diepte. De windowed-FFT-benadering voor het berekenen van de sarcoomlengte maakt gebruik van het voordeel van een verbeterde ruimtelijke resolutie, maar wordt geassocieerd met verminderde robuustheid (figuur 8D). In gevallen waarin troebele of trabeculae met een grote diameter moet worden bestudeerd, zal de oplosbaarheid van de FFT sterk worden verminderd als gevolg van het verminderde contrast dat gepaard gaat met de sarctische banderol in grotere weefselmonsters. Evenzo zullen binnen de LGO de tegenreflecties van een beelddiepte van meer dan 300 μm te zwak zijn om tijdens de segmentatiefase te worden opgelost. Daarom is onze techniek beperkt tot trabeculae met een diameter van minder dan 300 μm. Het wordt echter niet aanbevolen om monsters met een grote diameter te bestuderen, omdat er problemen kunnen zijn met diffusieve oxygenatie van de spierkern tijdens hoge stimulatiesnelheden17.
Onze methode maakt de beoordeling van de ionische mechanische functie in combinatie met spiergeometrie in gezonde en zieke spieren mogelijk, wat een krachtige benadering biedt voor het begrijpen van hartspierfysiologie, pathofysiologie en farmacologie. De hier beschreven pijplijn voor beeldverwerking extraheert gegevens die cruciaal zijn voor het verkrijgen van een dieper begrip van contractiele heterogeniteit. Een manier om het potentieel van zo’n rijke dataset volledig te realiseren, is door wiskundige modellen te bouwen die deze gegevens integreren en interpreteren, en om voorspellingen te doen die experimenteel kunnen worden getest met behulp van ons apparaat.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gefinancierd door Doctoral Scholarships van de University of Auckland (toegekend aan JD en MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 en 21/116) van de Health Research Council of New Zealand (toegekend aan respectievelijk J-CH aan KT), een doctoraatsbeurs toegekend door de National Heart Foundation (toegekend aan AA), Marsden Fast-Start grants (UOA1504 en UOA17) en een James Cook Research Fellowship van de Royal Society of New Zealand (toegekend aan AT). De oorspronkelijke ontwikkeling van dit instrument werd gefinancierd door een Marsden-subsidie (11-UOA-199) van de Royal Society of New Zealand (toegekend aan AT en PN).
2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
Heparin | Pfizer | 61024 | |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
Matlab | Mathworks | Data processing code | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
Powerload | Thermofisher | P10020 | |
Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
Transimpedance amplifier | Custom | ||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |