यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि स्वचालित माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास का संचालन करने के लिए माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) का उपयोग कैसे करें। एमएमसी स्वचालित रूप से और लगातार सूक्ष्मजीवों की खेती और उप-खेती कर सकता है और अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट और अच्छे समानांतरीकरण के साथ उनके विकास की ऑनलाइन निगरानी कर सकता है, जिससे श्रम और अभिकर्मक खपत कम हो जाती है।
पारंपरिक माइक्रोबियल खेती विधियों में आमतौर पर बोझिल संचालन, कम थ्रूपुट, कम दक्षता और श्रम और अभिकर्मकों की बड़ी खपत होती है। इसके अलावा, हाल के वर्षों में विकसित माइक्रोप्लेट-आधारित उच्च-थ्रूपुट खेती के तरीकों में खराब माइक्रोबियल विकास की स्थिति है और उनके कम भंग ऑक्सीजन, खराब मिश्रण और गंभीर वाष्पीकरण और थर्मल प्रभाव के कारण समानांतरीकरण का प्रयोग किया गया है। सूक्ष्म-बूंदों के कई फायदों के कारण, जैसे कि छोटी मात्रा, उच्च थ्रूपुट और मजबूत नियंत्रण क्षमता, बूंद-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक इन समस्याओं को दूर कर सकती है, जिसका उपयोग कई प्रकार के अनुसंधान में किया गया है उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबियल खेती, स्क्रीनिंग और विकास। हालांकि, अधिकांश पूर्व अध्ययन प्रयोगशाला निर्माण और आवेदन के चरण में रहते हैं। कुछ प्रमुख मुद्दे, जैसे कि उच्च परिचालन आवश्यकताएं, उच्च निर्माण कठिनाई, और स्वचालित एकीकरण प्रौद्योगिकी की कमी, माइक्रोबियल अनुसंधान में ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के व्यापक अनुप्रयोग को प्रतिबंधित करती हैं। यहां, एक स्वचालित माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) को ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के आधार पर सफलतापूर्वक विकसित किया गया था, जो माइक्रोबियल ड्रॉपलेट खेती की प्रक्रिया द्वारा आवश्यक टीकाकरण, खेती, ऑनलाइन निगरानी, उप-खेती, छंटाई और नमूनाकरण जैसे कार्यों के एकीकरण को प्राप्त करता है। इस प्रोटोकॉल में, जंगली-प्रकार के Escherichia coli (ई कोलाई) MG1655 और एक मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई तनाव (MeSV2.2) को स्वचालित और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास का संचालन करने के लिए एमएमसी का उपयोग करने के तरीके को पेश करने के लिए उदाहरण के रूप में लिया गया था। इस विधि को संचालित करना आसान है, कम श्रम और अभिकर्मकों का उपभोग करता है, और इसमें उच्च प्रयोगात्मक थ्रूपुट और अच्छा डेटा समानता है, जिसमें पारंपरिक खेती के तरीकों की तुलना में बहुत फायदे हैं। यह वैज्ञानिक शोधकर्ताओं के लिए संबंधित माइक्रोबियल अनुसंधान करने के लिए एक कम लागत, संचालन के अनुकूल और परिणाम-विश्वसनीय प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है।
माइक्रोबियल खेती सूक्ष्मजीवविज्ञानी वैज्ञानिक अनुसंधान और औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है, जिसका व्यापक रूप से सूक्ष्मजीवों के अलगाव, पहचान, पुनर्निर्माण, स्क्रीनिंग और विकास में उपयोग किया जाता है 1,2,3। पारंपरिक माइक्रोबियल खेती के तरीके मुख्य रूप से खेती के कंटेनरों के रूप में टेस्ट ट्यूब, शेक फ्लास्क और ठोस प्लेटों का उपयोग करते हैं, जो मिलाते हुए इनक्यूबेटर, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, माइक्रोप्लेट रीडर और माइक्रोबियल खेती, पता लगाने और स्क्रीनिंग के लिए अन्य उपकरणों के साथ संयुक्त होते हैं। हालांकि, इन तरीकों में कई समस्याएं हैं, जैसे बोझिल संचालन, कम थ्रूपुट, कम दक्षता, और श्रम और अभिकर्मकों की बड़ी खपत। हाल के वर्षों में विकसित उच्च-थ्रूपुट खेती के तरीके मुख्य रूप से माइक्रोप्लेट पर आधारित हैं। लेकिन माइक्रोप्लेट में भंग ऑक्सीजन, खराब मिश्रण संपत्ति, और गंभीर वाष्पीकरण और थर्मल प्रभाव का निम्न स्तर होता है, जो अक्सर खराब विकास की स्थिति और सूक्ष्मजीवों के समानांतरीकरण का प्रयोग करता है 4,5,6,7; दूसरी ओर, इसे महंगे उपकरणों से सुसज्जित करने की आवश्यकता है, जैसे कि तरल-हैंडलिंग वर्कस्टेशन और माइक्रोप्लेट रीडर, स्वचालित खेती और प्रक्रिया का पता लगानेके लिए 8,9 प्राप्त करने के लिए।
माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी की एक महत्वपूर्ण शाखा के रूप में, बूंद माइक्रोफ्लुइडिक्स को हाल के वर्षों में पारंपरिक निरंतर-प्रवाह माइक्रोफ्लुइडिक प्रणालियों के आधार पर विकसित किया गया है। यह एक असतत प्रवाह माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक है जो बिखरे हुए सूक्ष्म-बूंदों को उत्पन्न करने और उन पर काम करने के लिए दो immiscible तरल चरणों (आमतौर पर तेल-पानी) का उपयोग करतीहै। क्योंकि सूक्ष्म-बूंदों में छोटी मात्रा, बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र, उच्च आंतरिक द्रव्यमान हस्तांतरण दर, और कंपार्टमेंटलाइजेशन के कारण कोई क्रॉस-संदूषण नहीं होता है, और मजबूत नियंत्रण क्षमता और बूंदों के उच्च थ्रूपुट के फायदे होते हैं, इसलिए उच्च-थ्रूपुट खेती, स्क्रीनिंग और सूक्ष्मजीवों के विकास में ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक को लागू करने वाले कई प्रकार के शोध हुए हैं। . हालांकि, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक को लोकप्रिय और व्यापक रूप से लागू करने के लिए अभी भी प्रमुख मुद्दों की एक श्रृंखला है। सबसे पहले, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स का संचालन बोझिल और जटिल है, जिसके परिणामस्वरूप ऑपरेटरों के लिए उच्च तकनीकी आवश्यकताएं होती हैं। दूसरे, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक ऑप्टिकल, मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल घटकों को जोड़ती है और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोग परिदृश्यों से जुड़ी होने की आवश्यकता है। एक एकल प्रयोगशाला या टीम के लिए कुशल बूंद माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण प्रणाली का निर्माण करना मुश्किल है यदि कोई बहु-अनुशासनात्मक सहयोग नहीं है। तीसरा, माइक्रो-ड्रॉपलेट की छोटी मात्रा (पिकोलिटर (पीएल) से माइक्रोलीटर (μL) तक) के कारण, कुछ बुनियादी माइक्रोबियल संचालन जैसे उप-खेती, छंटाई और नमूने के लिए बूंदों के सटीक स्वचालित नियंत्रण और वास्तविक समय ऑनलाइन पता लगाने का एहसास करने में बहुत कठिनाई होती है, और एक एकीकृत उपकरण प्रणाली12 का निर्माण करना भी मुश्किल है।
उपरोक्त समस्याओं को हल करने के लिए, एक स्वचालित माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) को ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक13 के आधार पर सफलतापूर्वक विकसित किया गया था। एमएमसी में चार कार्यात्मक मॉड्यूल होते हैं: एक बूंद पहचान मॉड्यूल, एक बूंद स्पेक्ट्रम का पता लगाने वाला मॉड्यूल, एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप मॉड्यूल, और एक नमूना मॉड्यूल। सभी मॉड्यूल के सिस्टम एकीकरण और नियंत्रण के माध्यम से, पीढ़ी, खेती, माप (ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) और प्रतिदीप्ति), विभाजन, संलयन, बूंदों की छंटाई सहित स्वचालित संचालन प्रणाली सटीक रूप से स्थापित की जाती है, जो माइक्रोबियल ड्रॉपलेट खेती की प्रक्रिया द्वारा आवश्यक टीकाकरण, खेती, निगरानी, उप-खेती, छंटाई और नमूनाकरण जैसे कार्यों के एकीकरण को प्राप्त करती है। एमएमसी 2-3 μL मात्रा की 200 प्रतिकृति बूंद खेती इकाइयों को पकड़ सकता है, जो 200 शेक फ्लास्क खेती इकाइयों के बराबर है। सूक्ष्म-बूंद खेती प्रणाली सूक्ष्मजीवों के विकास के दौरान गैर-संदूषण, भंग ऑक्सीजन, मिश्रण और द्रव्यमान-ऊर्जा विनिमय की आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है, और कई एकीकृत कार्यों के माध्यम से माइक्रोबियल अनुसंधान की विभिन्न जरूरतों को पूरा कर सकती है, उदाहरण के लिए, विकास वक्र माप, अनुकूली विकास, एकल कारक बहु-स्तरीय विश्लेषण, और मेटाबोलाइट अनुसंधान और विश्लेषण (प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आधार पर)13,14।
यहां, प्रोटोकॉल का परिचय है कि एमएमसी का उपयोग स्वचालित और माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास को विस्तार से करने के लिए कैसे किया जाए (चित्रा 1)। हमने विकास वक्र माप और एमएमसी में अनुकूली विकास को प्रदर्शित करने के लिए मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई स्ट्रेन MeSV2.2 15 को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में जंगली-प्रकार के Escherichia coli (ई कोलाई)MG1655 को लिया। एमएमसी के लिए एक ऑपरेशन सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था, जो ऑपरेशन को बहुत सरल और स्पष्ट बनाता है। पूरी प्रक्रिया में, उपयोगकर्ता को प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान तैयार करने, एमएमसी की शर्तों को सेट करने और फिर एमएमसी में बैक्टीरिया समाधान और संबंधित अभिकर्मकों को इंजेक्ट करने की आवश्यकता होती है। इसके बाद, एमएमसी स्वचालित रूप से ड्रॉपलेट जनरेशन, मान्यता और नंबरिंग, खेती और अनुकूली विकास जैसे संचालन करेगा। यह उच्च समय रिज़ॉल्यूशन के साथ बूंदों का ऑनलाइन पता लगाने (ओडी और प्रतिदीप्ति) भी करेगा और सॉफ़्टवेयर में संबंधित डेटा (जिसे निर्यात किया जा सकता है) प्रदर्शित करेगा। ऑपरेटर परिणामों के अनुसार किसी भी समय खेती की प्रक्रिया को रोक सकता है और बाद के प्रयोगों के लिए लक्ष्य बूंदों को निकाल सकता है। एमएमसी को संचालित करना आसान है, कम श्रम और अभिकर्मकों का उपभोग करता है, और अपेक्षाकृत उच्च प्रयोगात्मक थ्रूपुट और अच्छे डेटा समानता है, जिसमें पारंपरिक खेती विधियों की तुलना में महत्वपूर्ण फायदे हैं। यह शोधकर्ताओं को संबंधित माइक्रोबियल अनुसंधान करने के लिए एक कम लागत, संचालन के अनुकूल और मजबूत प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कि स्वचालित माइक्रोबियल खेती और दीर्घकालिक अनुकूली विकास करने के लिए माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) का उपयोग कैसे किया जाए। एमएमसी एक लघुकृत, स्वचा?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFA0901500), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21627812) के राष्ट्रीय प्रमुख वैज्ञानिक साधन और उपकरण परियोजना और सिंघुआ विश्वविद्यालय पहल वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यक्रम (20161080108) द्वारा समर्थित किया गया था। हम मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई स्ट्रेन संस्करण 2.2 (MeSV2.2) के प्रावधान के लिए प्रोफेसर जूलिया ए वोरहोल्ट (माइक्रोबायोलॉजी संस्थान, जीव विज्ञान विभाग, ईटीएच ज्यूरिख, ज्यूरिख 8093, स्विट्जरलैंड) को भी धन्यवाद देते हैं।
0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |