Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando Sistema de Cultura microbiana de microdroplet (MMC)
Summary
Este protocolo descreve como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa. A MMC pode cultivar e subsu cultivar microrganismos automaticamente e continuamente e monitorar on-line seu crescimento com rendimento relativamente alto e boa paraleloização, reduzindo o consumo de mão-de-obra e reagente.
Abstract
Os métodos convencionais de cultivo microbiano geralmente têm operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Além disso, os métodos de cultivo de alto rendimento baseados em microplaca desenvolvidos nos últimos anos têm baixo status de crescimento microbiano e paraleloização de experimentos devido ao seu baixo oxigênio dissolvido, mistura pobre e evaporação severa e efeito térmico. Devido a muitas vantagens das micro-gotículas, como pequeno volume, alto rendimento e forte controlabilidade, a tecnologia microfluidica baseada em gotículas pode superar esses problemas, que tem sido usado em muitos tipos de pesquisa de cultivo microbiano de alto rendimento, triagem e evolução. No entanto, a maioria dos estudos anteriores permanece na fase de construção e aplicação laboratorial. Algumas questões-chave, como altos requisitos operacionais, alta dificuldade de construção e falta de tecnologia de integração automatizada, restringem a ampla aplicação da tecnologia microfluidica gotícula em pesquisa microbiana. Aqui, um sistema automatizado de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluida de gotículas, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento on-line, subculo, classificação e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. Neste protocolo, escherichia coli (E. coli) MG1655 e uma cepa E. coli (MeSV2.2) de tipo selvagem foram tomadas como exemplos para introduzir como usar o MMC para realizar o cultivo microbiano automatizado e relativamente de alto rendimento e a evolução adaptativa em detalhes. Este método é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem alto rendimento experimental e boa paraleloidade de dados, o que tem grandes vantagens em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e confiável para pesquisadores científicos realizarem pesquisas microbianas relacionadas.
Introduction
O cultivo microbiano é uma importante base para pesquisas científicas microbiológicas e aplicações industriais, amplamente utilizadas no isolamento, identificação, reconstrução, triagem e evolução dos microrganismos 1,2,3. Os métodos convencionais de cultivo de microbianos usam principalmente tubos de ensaio, frascos de shake e placas sólidas como recipientes de cultivo, combinados com incubadoras de agitação, espectrofotômetros, leitores de microplaca e outros equipamentos para cultivo, detecção e triagem de microbianas. No entanto, esses métodos têm muitos problemas, como operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Os métodos de cultivo de alto rendimento desenvolvidos nos últimos anos são baseados principalmente na microplaca. Mas a microplacão tem um baixo nível de oxigênio dissolvido, má mistura de propriedade, e evaporação severa e efeito térmico, que muitas vezes levam a um baixo status de crescimento e paraleloização de experimentos de microrganismos 4,5,6,7; por outro lado, ele precisa ser equipado com equipamentos caros, como estações de trabalho de manuseio líquido e leitores de microplaca, para alcançar o cultivo automatizado e detecção de processos 8,9.
Como um importante ramo da tecnologia microfluidica, os microfluidos de gotículas foram desenvolvidos nos últimos anos com base em sistemas microfluidos tradicionais de fluxo contínuo. É uma tecnologia microfluida de fluxo discreto que usa duas fases líquidas imiscíveis (geralmente óleo-água) para gerar micro-gotículas dispersas e operá-las10. Como as micro-gotículas têm as características de pequeno volume, grande área de superfície específica, alta taxa interna de transferência de massa e nenhuma contaminação cruzada causada pela compartimentação, e as vantagens da forte controlabilidade e alto rendimento de gotículas, houve muitos tipos de pesquisa aplicando tecnologia microfluidica gotícula no cultivo de alto rendimento, triagem e evolução dos microrganismos11 . No entanto, ainda há uma série de questões-chave para tornar a tecnologia microfluidica gotícula popularizada e amplamente aplicada. Em primeiro lugar, o funcionamento de microfluidos de gotículas é complicado e intrincado, resultando em altos requisitos técnicos para os operadores. Em segundo lugar, a tecnologia microfluidica de gotículas combina componentes ópticos, mecânicos e elétricos e precisa estar associada a cenários de aplicação de biotecnologia. É difícil para um único laboratório ou equipe construir sistemas eficientes de controle microfluídico gotícula se não houver colaboração multidisciplinar. Em terceiro lugar, por conta do pequeno volume de micro-gotículas (do picoliter (pL) ao microliter (μL),é preciso muita dificuldade para realizar o controle automatizado preciso e a detecção on-line em tempo real de gotículas para algumas operações microbianas básicas, como subculto, triagem e amostragem, e também é difícil construir um sistema de equipamento integrado12.
Para resolver os problemas acima, um sistema automático de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluídicagotícula 13. O MMC consiste em quatro módulos funcionais: um módulo de reconhecimento de gotículas, um módulo de detecção de espectro de gotículas, um módulo de chip microfluido e um módulo de amostragem. Através da integração e controle do sistema de todos os módulos, o sistema de operação automatizado inclui a geração, cultivo, medição (densidade óptica (OD) e fluorescência), divisão, fusão, classificação de gotículas é precisamente estabelecida, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento, subculonça, triagem e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. O MMC pode conter até 200 unidades de cultivo de gotículas de réplica de volume de 2-3 μL, o que equivale a 200 unidades de cultivo de frascos de shake. O sistema de cultivo de micro-gotículas pode satisfazer os requisitos de não contaminação, oxigênio dissolvido, mistura e troca de massa-energia durante o crescimento de microrganismos, e atender às várias necessidades de pesquisa microbiana através de múltiplas funções integradas, por exemplo, medição da curva de crescimento, evolução adaptativa, análise e análise metabólica de fator único (baseada na detecção e análise de fluorescência)13,14.
Aqui, o protocolo introduz como usar o MMC para realizar o cultivo automatizado e microbiano e a evolução adaptativa em detalhes (Figura 1). Tomamos escherichia coli (E. coli) MG1655 como exemplo para demonstrar a medição da curva de crescimento e uma cepa E. coli essencial de metanol MeSV2.215 para demonstrar a evolução adaptativa no MMC. Foi desenvolvido um software de operação para MMC, o que torna a operação muito simples e clara. Em todo o processo, o usuário precisa preparar a solução inicial de bactérias, definir as condições do MMC e, em seguida, injetar a solução de bactérias e reagentes relacionados no MMC. Posteriormente, o MMC executará automaticamente operações como geração de gotículas, reconhecimento e numeração, cultivo e evolução adaptativa. Ele também executará a detecção on-line (OD e fluorescência) das gotículas com resolução de alto tempo e exibirá os dados relacionados (que podem ser exportados) no software. O operador pode parar o processo de cultivo a qualquer momento de acordo com os resultados e extrair as gotículas-alvo para experimentos subsequentes. O MMC é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem rendimento experimental relativamente alto e boa paraleloidade de dados, que tem vantagens significativas em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e robusta para os pesquisadores realizarem pesquisas microbianas relacionadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa a longo prazo. MMC é um sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado e de alto rendimento. Em comparação com métodos e instrumentos convencionais de cultivo de alto rendimento microbiano, o MMC tem muitas vantagens, como baixo consumo de mão-de-obra e reagente, operação simples, detecção on-line (DCE e fluorescência), coleta de dados de a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2018YFA0901500), o Projeto Nacional de Instrumentos e Equipamentos Científicos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21627812) e o Programa de Pesquisa Científica da Iniciativa Universitária de Tsinghua (20161080108). Agradecemos também à Profª Julia A. Vorholt (Instituto de Microbiologia, Departamento de Biologia, ETH Zurique, Zurique 8093, Suíça) pelo fornecimento da cepa E. coli 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
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