बोने की संतानों से पहले जमे हुए कार्डियक ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स को मापना: व्यायाम-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक मॉडल
Summary
पहले जमे हुए संग्रहित ठोस ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध नमूनों की तैयारी ने जांचकर्ताओं को विभिन्न प्रयोगात्मक तौर-तरीकों में माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक और विश्लेषणात्मक मूल्यांकन दोनों करने की अनुमति दी। यह अध्ययन दर्शाता है कि जमे हुए दिल के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी कैसे तैयार की जाए और माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषणात्मक मूल्यांकन किए जाएं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स (ETC) प्रोफ़ाइल को एक व्यायाम बोने के लिए पैदा हुई संतानों के हृदय के ऊतकों में संशोधित किया जाता है। प्रस्तावित और परीक्षण की गई परिकल्पना यह थी कि गर्भावस्था के दौरान बोने का एक नियमित मातृ व्यायाम संतान हृदय बायोएनर्जेटिक्स की माइटोकॉन्ड्रियल दक्षता को बढ़ाएगा। इस परिकल्पना का परीक्षण माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी और सुपरकॉम्प्लेक्स प्रोफाइल का आकलन करने के लिए एक हल्के-अलगाव प्रक्रिया का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करके किया गया था। यहां वर्णित प्रक्रिया ने पहले जमे हुए संग्रहित हृदय ऊतकों के प्रसंस्करण के लिए अनुमति दी और माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी कॉम्प्लेक्स, सुपरकॉम्प्लेक्स और ईटीसी जटिल गतिविधि प्रोफाइल के मूल्यांकन के लिए ताजा माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी की आवश्यकता को समाप्त कर दिया। यह प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स्ड एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोब्लॉटिंग और नीले-देशी जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके सुपर जटिल मूल्यांकन में इष्टतम ईटीसी प्रोटीन जटिल माप का वर्णन करता है।
Introduction
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ऊतक के कम ऊर्जा यांत्रिक व्यवधान की एक नई तकनीक के साथ पहले जमे हुए दिल के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करना था जो ऊतक लाइसिस और माइटोकॉन्ड्रिया के निष्कर्षण में सुधार करता है। इस विधि के साथ, उच्च कतरनी तनाव या उच्च तापमान और कम homogenization समय (10-12 s) उत्पन्न किए बिना निष्कर्षण दक्षता में सुधार प्राप्त करने योग्य हो जाते हैं।
संग्रहीत जमे हुए ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त करने के लिए कार्यात्मक 2 और जैव रासायनिक अध्ययन दोनों को निष्पादित करने के लिए एक मूल्यवान संपत्ति है3 अन्यथा सटीक प्रयोगात्मक परिस्थितियों में आसानी से दोहराया जा सकता है। एक क्लासिक पॉटर-Elvehjem Teflon pestle ग्लास homogenizer या Dounce homogenizer का उपयोग किया गया है और अभी भी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में जिगर, गुर्दे और मस्तिष्क जैसे नरम ऊतकों को homogenize करने के लिए उपयोग किया जा रहा है। हालांकि, मांसपेशियों और हृदय जैसे कठोर ऊतकों को homogenizing अधिक homogenization समय, एंजाइम उपचार, उच्च गति homogenization, और व्यापक उपयोगकर्ता अनुभव की आवश्यकता होती है। यह मांसपेशियों और हृदय जैसे कठोर ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया जैसे बरकरार ऑर्गेनेल को निकालने के लिए हानिकारक है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए उच्च उपज माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए किया जाता है और हृदय के ऊतकों में उनके सुपरकॉम्प्लेक्स गठन का उपयोग किया जाता है, जो व्यायाम और गतिहीन बोने के लिए पैदा हुए संतानों से काटा जाता है, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए, और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। यह विधि उपयोगकर्ता को पहले जमे हुए संग्रहीत ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया समृद्ध तैयारी को अलग करने की अनुमति देती है।
गर्भवती कृन्तकों के लिए बाहरी नैनोमटेरियल एक्सपोजर गर्भावस्था के दौरान संतानों पर कार्डियक फ़ंक्शन और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और बायोएनर्जेटिक्स को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। फिर भी, गर्भावस्था के दौरान भ्रूण मायोसाइट्स बायोएनर्जेटिक्स में एरोबिक व्यायाम-प्रेरित सकारात्मक परिवर्तनों को अभी तक प्रलेखित नहीं किया गया है। हालांकि, उभरते हुए अध्ययन इस बात के सबूत प्रदान करते हैं कि गर्भावस्था के दौरान मातृ एरोबिक व्यायाम का भ्रूण के कार्डियक फ़ंक्शन 5 पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। आगे के सबूत प्रदान करने के लिए, गर्भावस्था के दौरान संतान कार्डियक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला परिसरों (यानी, कॉम्प्लेक्स वी के माध्यम से जटिल मैं) पर मातृ व्यायाम के अनुदैर्ध्य प्रभावों का विश्लेषण किया गया था।
इस अध्ययन में महत्वपूर्ण स्वास्थ्य प्रासंगिकता है क्योंकि परिणाम यह सुझाव दे सकते हैं कि मातृ व्यायाम संतानों के कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया में ऊर्जा उत्पादन की दक्षता में सुधार करता है। इस अध्ययन में, बोने (मादा सुअर) का उपयोग दो कारणों से एक पशु मॉडल के रूप में किया गया था: (i) कार्डियक फिजियोलॉजी मानव 6 के समान है, और (ii) विभिन्न समय बिंदुओं से संतानों से दिल के ऊतकों की फसल एक संस्थागत आईएसीयूसी अनुमोदन के तहत संभव है। प्रस्तावित अध्ययन का उद्देश्य मातृ व्यायाम और संतानों के हृदय ऊतक के सेलुलर और जैव रासायनिक मेकअप पर इसके संभावित सकारात्मक प्रभावों को जोड़ने वाले कई मौलिक सवालों के जवाब देना है। इस दृष्टिकोण के लिए लंबे और महंगे अनुदैर्ध्य अध्ययनों से प्राप्त पहले जमे हुए कार्डियक ऊतक से कोमल अभी तक प्रभावी माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव तकनीकों की आवश्यकता होती है जो गर्भावस्था के दौरान भ्रूण कार्डियक मायोसाइट्स के भीतर बायोएनर्जेटिक परिवर्तनों के मुद्दों को संबोधित करते हैं। इस अध्ययन में वर्णित विधि विश्लेषणात्मक और कार्यात्मक अध्ययनों दोनों के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी के लिए पहले से जमे हुए संग्रहीत ऊतक की बड़ी राशि का उपयोग करने की अनुमति देती है। अध्ययन प्रारंभिक डेटा प्रदान करके इस क्षेत्र में ज्ञान के अंतर को भरने में भी मदद करेगा, जिससे गर्भाशय में और उससे परे हृदय स्वास्थ्य पर मातृ व्यायाम के प्रभावों को निर्धारित करने वाले भविष्य के अध्ययन हो सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण चरणों को यहां इंगित किया गया है। सबसे पहले, ऊतक समरूपता को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए ताकि ऊतक समरूपता प्रक्रिया के दौरान अत्यधिक सरासर प्रभाव लागू न किया जा सके। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को डैनियल बैरेरा के लिए अब्दुलबाकी एजबास और ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप के लिए कैनसस सिटी यूनिवर्सिटी के इंट्राम्यूरल अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। लेखक डॉ जान टैली के संपादकीय काम के लिए आभारी हैं।
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
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