قياس مجمعات نقل الإلكترونات الميتوكوندريا في الأنسجة القلبية المجمدة سابقا من ذرية سو: نموذج لتقييم التغيرات في الجيوجيات الحيوية الميتوكوندريا الناجمة عن ممارسة الرياضة
Summary
وسمح إعداد عينات غنية بالميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة المحفوظة المجمدة سابقا للمحققين بإجراء تقييمات وظيفية وتحليلية على حد سواء للميتوكوندريا في مختلف الطرائق التجريبية. توضح هذه الدراسة كيفية إعداد الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة وإجراء تقييمات تحليلية للميتوكوندريا.
Abstract
يتم تعديل ملف تعريف مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) في أنسجة القلب للنسل المولود لبذر ممارس. كانت الفرضية المقترحة والمختبرة هي أن ممارسة الأمومة المنتظمة للبذر أثناء الحمل من شأنها أن تزيد من كفاءة الميتوكوندريا للذرية الحيوية للقلب. تم اختبار هذه الفرضية عن طريق عزل الميتوكوندريا باستخدام إجراء عزل خفيف لتقييم الميتوكوندريا ETC وملامح supercomplex. سمح الإجراء الموصوف هنا بمعالجة أنسجة القلب المحفوظة المجمدة سابقا وقضى على ضرورة إعداد الميتوكوندريا الطازج لتقييم مجمعات الميتوكوندريا ETC ، والتكتل الفائق ، وملامح النشاط المعقدة ETC. يصف هذا البروتوكول القياس الأمثل لمجمع بروتين ETC في الانتفاخ المناعي متعدد الأجسام المضادة والتقييم المعقد للغاية باستخدام الكهربائي الهلامي الأزرق الأصلي.
Introduction
كان الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوات مفصلة للحصول على إعداد غني بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة سابقا مع تقنية جديدة من الاضطراب الميكانيكي منخفض الطاقة للأنسجة التي تحسن تحلل الأنسجة واستخراج الميتوكوندريا. مع هذه الطريقة، وتحسين كفاءة استخراج دون توليد إجهاد القص عالية أو ارتفاع درجة الحرارة ووقت التجانس قصيرة (10-12 ق) تصبح قابلة للتحقيق1.
للحصول على الميتوكوندريا من الأنسجة المجمدة المؤرشفة هو رصيدا قيما لإجراء كل من functional2 والدراسات الكيميائية الحيوية3 خلاف ذلك لا يمكن تكرارها بسهولة في ظل الظروف التجريبية الدقيقة. وقد استخدمت الكلاسيكية بوتر-Elvehjem تفلون حشرات الزجاج المتجانس أو Dounce المتجانس ولا يزال يستخدم في مختبرات البحوث لتجانس الأنسجة الرخوة مثل الكبد والكلى والدماغ. ومع ذلك، يتطلب تجانس الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب المزيد من الوقت للتجانس، وعلاج الإنزيم، والتجانس عالي السرعة، وخبرة واسعة للمستخدم. هذا غير مؤات لاستخراج العضيات سليمة مثل الميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب. تستخدم الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على إعداد عالي الغلة غني بالميتوكوندريا لتحليل مجمعات البروتين في سلسلة نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) وتكوينها الفائق في أنسجة القلب التي يتم حصادها من النسل المولود لزرع التمارين الرياضية والمستقرة ، والمجمدة فلاش في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تسمح هذه الطريقة للمستخدم بعزل إعداد الميتوكوندريا المخصب عن الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا.
يمكن أن يؤثر التعرض الخارجي للمواد النانوية للقوارض الحامل سلبا على وظيفة القلب والتنفس الميتوكوندريا والجيوجيات الحيوية على السلف أثناء الحمل4. ومع ذلك، لم يتم بعد توثيق التغيرات الإيجابية الناجمة عن التمارين الهوائية في الجيوجيات الحيوية للخلايا العضلية الجنينية أثناء الحمل. ومع ذلك، تقدم الدراسات الناشئة أدلة على أن التمارين الهوائية الأمومية أثناء الحمل لها تأثير إيجابي على وظيفة قلب الجنين5. ومن أجل تقديم المزيد من الأدلة، تم إجراء تحليل للآثار الطولية لممارسة الأمهات على مجمعات سلسلة الميتوكوندريا القلبية للنسل (أي المجمع 1 من خلال المجمع الخامس) أثناء الحمل.
هذه الدراسة لها أهمية صحية كبيرة لأن النتائج قد تشير إلى أن ممارسة الأم يحسن كفاءة إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا القلبية للذرية. في هذه الدراسة، تم استخدام البذرات (أنثى الخنزير) كنموذج حيواني لسببين: (1) فسيولوجيا القلب مشابهة ل human6، و (2) حصاد أنسجة القلب من النسل من نقاط زمنية مختلفة ممكن بموجب موافقة IACUC المؤسسية. تهدف الدراسة المقترحة إلى الإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية التي تربط بين ممارسة الأم وآثارها الإيجابية المحتملة على التركيب الخلوي والكيميائي الحيوي لأنسجة قلب النسل. يتطلب هذا النهج تقنيات عزل الميتوكوندريا اللطيفة والفعالة من أنسجة القلب المجمدة سابقا التي تم الحصول عليها من الدراسات الطولية الطويلة والمكلفة التي تناولت قضايا التغيرات الحيوية داخل خلايا قلب الجنين أثناء الحمل. تسمح الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة باستخدام مبالغ كبيرة من الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا لإعداد الميتوكوندريا المخصب لكل من الدراسات التحليلية والوظيفية. وستساعد الدراسة أيضا على سد الفجوة المعرفية في هذا المجال من خلال توفير بيانات أولية، مما قد يؤدي إلى دراسات مستقبلية تحدد آثار ممارسة الأمهات على صحة القلب في الرحم وخارجه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتم الإشارة إلى الخطوات الهامة لهذا البروتوكول هنا. أولا، ينبغي التعامل مع تجانس الأنسجة بعناية بحيث لا يتم تطبيق الآثار المفرطة خلال عملية تجانس الأنسجة. وينبغي استخدام التقطيع الأنسجة، وهو جزء من تكنولوجيا ركوب الدراجات الضغط (PCT) لتجانس الأنسجة الأولي9. هذه الخطوة سوف تقلل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منحة جامعة كانساس سيتي الداخلية لعبد الباقي أغباس وزمالة أبحاث الصيف لدانيال باريرا. المؤلفون ممتنون لعمل الدكتور جان تالي التحريري.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
