Måling Mitokondrie Elektron Overførsel Komplekser i tidligere frosne hjertevæv fra afkom af so: En model til at vurdere Motion-induceret Mitokondrie Bioenergetics Ændringer
Summary
Fremstilling af mitokondrier-berigede prøver fra tidligere frosne arkiverede faste væv gjorde det muligt for efterforskerne at udføre både funktionelle og analytiske vurderinger af mitokondrier i forskellige eksperimentelle modaliteter. Denne undersøgelse viser, hvordan man forbereder mitokondrier-berigede præparater fra frossen hjertevæv og udfører analytiske vurderinger af mitokondrier.
Abstract
Mitokondrie elektron overførsel kompleks (ETC) profil er ændret i hjertet væv af afkom født til en udøvet so. Den hypotese foreslået og testet var, at en regelmæssig moderens udøvelse af en so under graviditeten ville øge mitokondrie effektiviteten af afkom hjerte bioenergetik. Denne hypotese blev testet ved at isolere mitokondrier ved hjælp af en mild-isolation procedure til at vurdere mitokondrie ETC og supercomplex profiler. Den procedure, der er beskrevet her, gjorde det muligt at behandle tidligere frosne arkiverede hjertevæv og eliminerede nødvendigheden af frisk mitokondrier forberedelse til vurdering af mitokondrie ETC komplekser, superkomplekser og ETC komplekse aktivitetsprofiler. Denne protokol beskriver den optimale ETC protein komplekse måling i multiplexed antistof-baseret immunblotting og super kompleks vurdering ved hjælp af blå-native gel elektroforese.
Introduction
Målet med denne protokol var at give detaljerede skridt til at opnå mitokondrier-beriget præparat fra tidligere frosset hjertevæv med en ny teknologi af lav energi mekanisk forstyrrelse af væv, der forbedrer væv lysis og ekstraktion af mitokondrier. Med denne metode bliver forbedret ekstraktionseffektivitet uden at generere høj forskydningsstress eller høj temperatur og kort homogeniseringstid (10-12 s) opnåelig1.
At opnå mitokondrier fra arkiveret frosset væv er et værdifuldt aktiv til at udføre både funktionelle2 og biokemiske undersøgelser3 ellers ikke let gentages under de nøjagtige eksperimentelle forhold. En klassisk Potter-Elvehjem Teflon støder glas homogenisator eller Dounce homogenisator er blevet brugt og bruges stadig i forskningslaboratorier til at homogenisere blødt væv som lever, nyre og hjerne. Men, homogenisering hårdt væv såsom muskler og hjerte kræver mere homogenisering tid, enzym behandling, høj hastighed homogenisering, og omfattende brugeroplevelse. Dette er ufordelagtigt for udvinding intakte organeller såsom mitokondrier fra hårdt væv såsom muskler og hjerte. Den metode, der er beskrevet i denne protokol, anvendes til at opnå højtydende mitokondrier-beriget præparat til analyse af mitokondrie elektron transportkæde (ETC) proteinkomplekser og deres superkompleks dannelse i hjertevæv høstet fra afkom født til udøvet og stillesiddende so, flash-frosset i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C til fremtidig brug. Denne metode giver brugeren mulighed for at isolere mitokondrier beriget forberedelse fra tidligere frosne arkiverede væv.
Ekstern nanomaterialeeksponering for gravide gnavere kan have en negativ indvirkning på hjertefunktionen og mitokondrie respiration og bioenergetics på afkom under svangerskab4. Ikke desto mindre, aerob motion-induceret positive ændringer i fosteret myocyt bioenergetics under graviditeten er endnu ikke dokumenteret. Men, nye undersøgelser giver bevis for, at moderens aerob træning under graviditeten har en positiv indflydelse på fosterets hjertefunktion5. For at give yderligere dokumentation blev der foretaget en analyse af de langsgående virkninger af moderøvelse på afkom af hjerte mitokondrie respiratoriske kædekomplekser (dvs. Kompleks I gennem Kompleks V) under graviditeten.
Denne undersøgelse har betydelig sundhedsrelevans, da resultaterne kan tyde på, at moderøvelse forbedrer effektiviteten af energiproduktionen i hjerte mitokondrier af afkom. I denne undersøgelse blev søer (hunsvin) brugt som dyremodel af to grunde: (i) hjertefysiologi ligner human6, og (ii) hjertevævshøst fra afkom fra forskellige tidspunkter er mulig under en institutionel IACUC-godkendelse. Den foreslåede undersøgelse har til formål at besvare mange af de grundlæggende spørgsmål, der forbinder moderlig motion og dens potentielle positive virkninger på den cellulære og biokemiske sammensætning af afkommets hjertevæv. Denne tilgang kræver blide, men effektive mitokondrierisolationsteknikker fra tidligere frosne hjertevæv fra de langvarige og dyre langsgående undersøgelser, der behandlede problemerne med de bioenergetiske ændringer i fostrets hjerte-myocytter under graviditeten. Den metode, der er beskrevet i denne undersøgelse tillader udnytte store summer af tidligere frosne arkiveret væv til mitokondrier-beriget forberedelse til både analytiske og funktionelle undersøgelser. Undersøgelsen vil også bidrage til at udfylde videnskløften på dette område ved at levere foreløbige data, hvilket kan føre til fremtidige undersøgelser, der bestemmer virkningerne af mødres motion på hjertesundhed i livmoderen og videre.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiske trin for denne protokol er angivet her. For det første skal vævs homogenisering håndteres omhyggeligt, således at der ikke påføres for store virkninger under vævs homogeniseringsprocessen. Der bør anvendes en vævs shredder, som er en del af trykcyklingsteknologi (PCT) til indledende vævs homogenisering9. Dette trin vil reducere den overdrevne slagtilfælde cyklus af glas-på-glas homogenisator (Figur 1B), der yderligere kan ødelægge allerede sk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev økonomisk støttet af Kansas City University’s intramural tilskud til Abdulbaki Agbas og Summer Research Fellowship for Daniel Barrera. Forfatterne er taknemmelige for Dr. Jan Talley’s redaktionelle arbejde.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
