في فيفو فحص المناعة للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية
Summary
تصف هذه المخطوطة كيفية تقييم المناعة في الجسم الحي للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا السرطانية (EVs) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تبدو المركبات الكهربائية المشتقة من الأورام التي تخضع لموت الخلايا المناعية الناجم عن العلاج ذات أهمية خاصة في المراقبة المناعية للورم. يجسد هذا البروتوكول تقييم المركبات الكهربائية للورم المناعي الناجم عن أوكساليبلاتين ولكن يمكن تكييفه مع مختلف الإعدادات.
Abstract
يمكن أن يؤدي موت الخلايا المناعية للأورام ، الناجم عن العلاج الكيميائي أو الإشعاعي ، إلى استجابات الخلايا التائية الخاصة بالورم عن طريق إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالخطر وتحفيز إنتاج الإنترفيرون من النوع الأول. تعتمد العلاجات المناعية، بما في ذلك تثبيط نقاط التفتيش، في المقام الأول على الخلايا التائية الخاصة بالورم الموجودة مسبقا للكشف عن تأثير علاجي. وبالتالي ، فإن النهج العلاجية التآزرية التي تستغل موت الخلايا المناعية كلقاح جوهري مضاد للسرطان قد تحسن استجابتها. ومع ذلك ، فإن طيف العوامل المناعية التي تطلقها الخلايا تحت الضغط الناجم عن العلاج لا يزال غير مميز تماما ، خاصة فيما يتعلق بالحويصلات خارج الخلية (EVs). تعتبر المركبات الكهربائية ، وهي جزيئات غشائية نانوية الحجم تنبعث من جميع الخلايا تقريبا ، تسهل الاتصال بين الخلايا ، وفي السرطان ، ثبت أنها تتوسط في التحضير المتبادل ضد مستضدات الورم. لتقييم التأثير المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الأورام في ظل ظروف مختلفة ، يتم البحث عن طرق قابلة للتكيف وقابلة للتطوير وصالحة. لذلك ، يتم تقديم نهج سهل وقوي نسبيا لتقييم مناعة المركبات الكهربائية في الجسم الحي . ويستند البروتوكول إلى تحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية بعد تحصين الفئران في الجسم الحي بالمركبات الكهربائية، معزولة عن طريق المقايسات القائمة على هطول الأمطار من مزارع الخلايا السرطانية تحت العلاج أو ظروف الحالة الثابتة. على سبيل المثال ، يظهر هذا العمل أن التعرض لأوكساليبلاتين لخلايا الورم الميلانيني الفئران B16-OVA أدى إلى إطلاق EVs المناعية التي يمكن أن تتوسط في تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا التفاعلية للورم. وبالتالي، فإن فحص المركبات الكهربائية عن طريق التحصين في الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي يحدد الظروف التي يمكن أن تظهر فيها المركبات الكهربائية المناعية. يوفر تحديد ظروف إطلاق EV المناعي شرطا أساسيا لاختبار الفعالية العلاجية للمركبات الكهربائية ضد السرطان واستكشاف الآليات الجزيئية الأساسية للكشف في نهاية المطاف عن رؤى جديدة حول دور EVs في علم المناعة السرطاني.
Introduction
يلعب الجهاز المناعي دورا محوريا في مكافحة السرطان ، سواء عند التحريض عليه عن طريق تثبيط نقاط التفتيش المناعية أو لفعالية علاجات السرطان التقليدية. يمكن للخلايا السرطانية التي تستسلم للعلاجات السامة للجينات مثل عوامل العلاج الكيميائي أوكساليبلاتين ودوكسوروبيسين، أو العلاج الإشعاعي المؤين أن تطلق مستضدات وأنماط جزيئية مرتبطة بالخطر (DAMPs) يحتمل أن تبدأ استجابة مناعية تكيفية مضادة للورم1. وتشمل أبرز DAMPs ، في سياق موت الخلايا المناعية ، إشارات find-me مثل ATP الكيميائي ، وإشارات eat-me مثل التعرض للكاليريتيكولين ، الذي يعزز امتصاص الخلايا السرطانية بواسطة الخلايا التي تقدم المستضدات ، وإطلاق HMGB1 ، الذي ينشط مستقبلات التعرف على الأنماط ، وبالتالي تعزيز العرض المتبادل لمستضدات الورم 2. علاوة على ذلك، يتم استشعار الإنترفيرون من النوع الأول (IFN-I)، المستحث عن طريق الأحماض النووية المناعية المشتقة من الورم أو غيرها من المحفزات، بواسطة الخلايا المتغصنة، مما يمكنها من إطلاق الخلايا التائية السامة للخلايا الخاصة بالورم بشكل فعال3،4. سريريا ، توفر خلايا CD8 + T المنشطة والمنتشرة التي تتسلل إلى الورم عاملا تنبؤيا مستقلا للبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة في العديد من مرضى السرطان. يتوسط IFN-γ ، الذي يتم إطلاقه من هذه الخلايا التائية المنشطة ، التأثيرات المباشرة المضادة للتكاثر على الخلايا السرطانية ويدفع استقطاب Th1 وتمايز الخلايا التائية السامة للخلايا ، مما يساهم في المراقبة المناعية الفعالة ضد السرطان5,6. أوكساليبلاتين هو محفز لموت الخلايا المناعية بحسن نية، ويتوسط مثل هذه الاستجابة المناعية التكيفية ضد السرطان7. ومع ذلك ، فإن العدد الكبير من الإشارات المناعية الأولية التي تطلقها الخلايا السرطانية تحت الضغط الناجم عن العلاج لا يزال يتعين الكشف عنها بالكامل. على الرغم من التقدم الكبير في العلاج المناعي للسرطان ، إلا أن توسيع فوائده لتشمل جزءا أكبر من المرضى لا يزال يمثل تحديا. قد يؤدي الفهم الأكثر تفصيلا للإشارات المناعية التي تبدأ تنشيط الخلايا التائية إلى توجيه تطوير علاجات جديدة.
يبدو أن مجموعة غير متجانسة من الهياكل المغلقة بالغشاء ، والمعروفة باسم الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، تعمل كأجهزة اتصال بين الخلايا. تحمل المركبات الكهربائية المنبعثة من جميع أنواع الخلايا تقريبا البروتينات الوظيفية والحمض النووي الريبي والحمض النووي والجزيئات الأخرى إلى الخلية المتلقية أو قد تغير الحالة الوظيفية للخلية فقط عن طريق الارتباط بالمستقبلات الموجودة على سطح الخلية. تختلف حمولتها النشطة بيولوجيا اختلافا كبيرا حسب نوع الخلية المولدة وحالتها الوظيفية8. في علم المناعة السرطاني، اعتبرت المركبات الكهربائية المنبعثة من الخلايا السرطانية في الغالب معادية للعلاج المناعي لأنها تعزز في نهاية المطاف النمو الغازي، وتشكل منافذ النقيلي9، وتثبط الاستجابة المناعية10. في المقابل، أظهرت بعض الدراسات أن المركبات الكهربائية يمكنها نقل مستضدات الورم إلى الخلايا المتغصنة من أجل عرض تقديمي فعال11,12. قد توفر المركبات الكهربائية الأحماض النووية المناعية إذا ظهرت تحت الضغط الناجم عن العلاج، مما يسهل الاستجابة المناعية المضادة للورم13،14. وقد ثبت مؤخرا أن استشعار مثل هذه الروابط المناعية الفطرية للحمض النووي الريبي والحمض النووي في البيئة الدقيقة للورم يعدل الاستجابة لحصار نقاط التفتيش بشكل كبير15،16،17. وبالتالي ، فإن الدور المناعي للمركبات الكهربائية التي تطلقها الخلايا السرطانية تحت ضغط مختلف يسببه العلاج يحتاج إلى مزيد من التوضيح. نظرا لأن المركبات الكهربائية تشكل مجالا بحثيا شابا ولكنه متنام ، فإن توحيد الأساليب لا يزال مستمرا. لذلك ، فإن تبادل المعرفة أمر ضروري لتحسين قابلية تكرار الأبحاث حول التفاعلات بين المركبات الكهربائية وعلم المناعة السرطاني. مع وضع ذلك في الاعتبار، تصف هذه المخطوطة بروتوكولا بسيطا لتقييم التأثير المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم في الجسم الحي.
يتم إجراء هذا التقييم عن طريق توليد EVs المشتقة من الورم ، وتحصين الفئران المتلقية مع تلك EVs ، وتحليل الخلايا التائية الطحالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم إجراء توليد EV بشكل مثالي عن طريق بذر خلايا ورم الفئران في وسط زراعة الخلايا الخالية من EV للحصول على درجة عالية من النقاء. يتم التعامل مع الخلايا بمحفز إجهاد خلوي محدد ، مثل العلاج الكيميائي ، لمقارنة تأثير EVs الناجم عن العلاج مع المناعة الأساسية للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم. يمكن إجراء عزل المركبات الكهربائية من خلال تقنيات مختلفة يجب اختيارها وفقا للتطبيق في الجسم الحي والتوافر المحلي. يصف البروتوكول التالي فحصا قائما على هطول الأمطار مع مجموعة تجارية لتنقية EV. يتم تحصين الفئران مرتين مع تلك المركبات الكهربائية. بعد أربعة عشر يوما من الحقن الأول ، يتم استخراج الخلايا التائية من الطحال وتحليلها لإنتاج IFN-γ عن طريق قياس التدفق الخلوي لتقييم الاستجابة المناعية الجهازية. مع هذا، يتم تقييم إمكانات المركبات الكهربائية المشتقة من الورم، والتي تظهر في ظل أنظمة علاجية مختلفة، للحث على استجابات الخلايا التائية المضادة للورم بسهولة نسبية وبسرعة وبصلاحية عالية13. لذلك ، هذه الطريقة مناسبة للفحص المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية في ظل ظروف مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول تقييما مناعيا في الجسم الحي للمركبات الكهربائية المشتقة من خلايا سرطان الجلد تحت الضغط الناجم عن العلاج الكيميائي أثناء التكيف مع المركبات الكهربائية المنبعثة من أنواع السرطان المختلفة تحت علاجات مختلفة. على سبيل المثال، يؤدي تحصين الفئران بالمركبات الكهربائي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) – Projektnummer 360372040 – SFB 1335 و Projektnummer 395357507 – SFB 1371 (إلى H.P.) ، وهي منحة بحثية Mechtild Harf من مؤسسة DKMS لإعطاء الحياة (إلى H.P.) جائزة الباحث الشاب من قبل تحالف أبحاث سرطان الجلد (إلى S.H.) ، وهي منحة دراسية من قبل مؤسسة Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (إلى F.S.) ، صندوق تأسيسي من الجامعة التقنية في ميونيخ (إلى S.H) ومنحة بحثية من مؤسسة فيلهلم ساندر (2021.041.1 ، إلى S.H.). يتم دعم H. P. من قبل برنامج EMBO للمحققين الشباب.
مساهمات المؤلف:
قام F.S. ، H.P. ، و S.H. بتصميم البحث وتحليله وتفسيره للنتائج. كتب ف. س. و س. ه. المخطوطة. قام H.P. و S.H. بتوجيه الدراسة.
Materials
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
