생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

Summary

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

Abstract

화학요법 또는 방사선 조사에 의해 야기된 종양의 면역원성 세포 사멸은 위험-관련 분자 패턴을 방출하고 타입 I 인터페론의 생산을 유도함으로써 종양 특이적 T 세포 반응을 촉발시킬 수 있다. 체크포인트 억제를 포함한 면역요법은 주로 치료 효과를 전개하기 위해 기존의 종양 특이적 T 세포에 의존한다. 따라서, 면역원성 세포 사멸을 내재적 항암 백신으로서 이용하는 상승적 치료 접근법은 그들의 반응성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 세포에 의해 방출되는 면역원성 인자의 스펙트럼은 특히 세포밖 소포(EVs)와 관련하여 불완전하게 특성화되어 있다. 거의 모든 세포에서 방출되는 나노 규모의 막성 입자 인 EVs는 세포 간 통신을 용이하게하는 것으로 간주되며, 암에서는 종양 항원에 대한 교차 프라이밍을 매개하는 것으로 나타났습니다. 다양한 조건하에서 종양으로부터 유래된 EVs의 면역원성 효과를 평가하기 위해, 적응가능하고, 확장 가능하고, 유효한 방법들이 요구된다. 따라서, 본원에서 EVs’의 생체내 면역원성을 평가하기 위해 비교적 쉽고 강력한 접근법이 제시된다. 이 프로토콜은 EVs로 마우스를 생체내 면역화한 후 비장 T 세포의 유세포 분석 분석에 기초하며, 치료 또는 정상 상태 조건 하에서 종양 세포 배양물로부터 침전 기반 분석에 의해 단리된다. 예를 들어, 이 연구는 B16-OVA 뮤린 흑색종 세포의 옥살리플라틴 노출이 종양 반응성 세포독성 T 세포의 활성화를 매개할 수 있는 면역원성 EVs의 방출을 가져왔다는 것을 보여준다. 따라서, 생체내 면역화 및 유동 세포측정법을 통한 EV의 스크리닝은 면역원성 EV가 출현할 수 있는 조건을 식별한다. 면역원성 EV 방출의 조건을 확인하는 것은 암에 대한 EV의 치료 효능을 테스트하고 암 면역학에서 EV의 역할에 대한 새로운 통찰력을 궁극적으로 공개하기 위해 근본적인 분자 메커니즘을 탐구하는 데 필수적인 전제 조건을 제공합니다.

Introduction

면역 체계는 면역 체크포인트 억제에 의해 유발될 때와 종래의 암 치료법의 효능에 대해 암과의 싸움에서 중추적인 역할을 한다. 화학요법제인 옥살리플라틴 및 독소루비신과 같은 유전독성 요법에 굴복하거나 이온화 방사선 치료로 인해 항원 및 잠재적으로 적응성 항종양 면역 반응을 개시하는 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 방출할 수 있다¹. 면역원성 세포 사멸의 맥락에서 가장 두드러진 DAMPs는 화학주성 ATP와 같은 find-me 신호, 칼레티쿨린의 노출과 같은 먹거리-나 신호, 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 흡수를 촉진하고, 패턴 인식 수용체를 활성화시켜 종양 항원의 교차 제시를 증진시키는 HMGB1의 방출^{을 포함한다2}. 또한, 종양 유래 면역원성 핵산 또는 다른 자극을 통해 유도되는 I형 인터페론(IFN-I)은 수지상 세포에 의해 감지되어 종양 특이적 세포독성 T 세포를 효과적으로 프라이밍할 수 있게 한다^3,4. 임상적으로, 활성화되고 증식하는 CD8⁺ T 세포는 종양에 침윤하여 많은 암 환자에서 장기간 생존을 위한 독립적인 예후 인자를 제공한다. 이러한 활성화된 T 세포로부터 방출된 IFN-γ은 암 세포에 대한 직접적인 항증식 효과를 매개하고 Th1 분극화 및 세포독성 T 세포 분화를 유도하여 암에 대한 효과적인 면역감시에 기여한다^5,6. 옥살리플라틴은 암에 대한 이러한 적응성 면역 반응을 매개하는 선의의 면역원성 세포 사멸 유도제^이다7. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 종양 세포에 의해 방출되는 초기 면역원성 신호의 과다함은 완전히 밝혀진 채로 남아 있다. 암 면역 요법의 상당한 발전에도 불구하고, 환자의 더 많은 부분에 그 혜택을 확대하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. T 세포 활성화를 개시하는 면역원성 신호에 대한 보다 상세한 이해는 새로운 치료법의 개발을 안내할 수 있다.

세포밖 소포 (EVs)로 알려진 막으로 둘러싸인 구조의 이종 그룹은 세포 간 통신 장치 역할을하는 것으로 보인다. 거의 모든 세포 유형에 의해 방출되는 EV는 기능적 단백질, RNA, DNA 및 기타 분자를 수용자 세포에 운반하거나 세포 표면의 수용체에 결합함으로써 세포의 기능 상태를 변경할 수 있습니다. 이들의 생물학적 활성 화물은 생성 세포의 유형 및 기능 상태에 따라 크게 달라진다⁸. 암 면역학에서, 종양 세포로부터 방출된 EV는 결국 침습적 성장을 촉진하고, 전이성 틈새를 형성하며⁹, 면역 반응을 억제하기 때문에 면역요법에 대한 적대적인 것으로 우세하게 간주되어 왔다¹⁰. 대조적으로, 일부 연구는 EV가 효과적인 교차 프리젠 테이션을 위해 종양 항원을 수지상 세포로 옮길 수 있음을 보여주었습니다^11,12. EVs는 치료-유도된 스트레스 하에서 출현하는 경우 면역자극성 핵산을 제공할 수 있고, 항종양 면역 반응을 촉진시킨다^13,14. 종양 미세환경에서 이러한 RNA 및 DNA 선천적 면역 리간드의 감지는 최근 체크포인트 봉쇄에 대한 반응성을 유의적으로 조절하는 것으로 나타났다^15,16,17. 따라서, 상이한 요법-유도된 스트레스 하에서 종양 세포에 의해 방출되는 EVs의 면역원성 역할은 추가로 해명될 필요가 있다. EV는 젊지만 성장하는 연구 분야를 구성하기 때문에 방법의 표준화는 여전히 진행 중입니다. 따라서 EV와 암 면역학 간의 상호 작용에 대한 연구 재현성을 향상시키기 위해 지식을 공유하는 것이 필수적입니다. 이를 염두에두고,이 원고는 생체 내에서 종양 유래 EV의 면역원성 효과를 평가하기위한 간단한 프로토콜을 설명합니다.

이 평가는 종양 유래 EV를 생성하고, 수용자 마우스를 그 EV로 면역화하고, 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포를 분석함으로써 수행됩니다. EV 생성은 뮤린 종양 세포를 높은 순도의 EV가 없는 세포 배양 배지에 시딩함으로써 이상적으로 수행된다. 세포는 화학요법과 같은 특정 세포 스트레스 자극으로 처리되어, 치료-유도된 EVs의 효과를 각각의 종양 유래 EVs의 기준선 면역원성과 비교한다. EV들의 단리는 생체내 적용가능성 및 국부적 이용가능성에 따라 선택되어야 하는 다양한 기술들에 의해 잘 수행될 수 있다. 다음 프로토콜은 EV 정제를 위한 상용 키트를 사용한 침전 기반 분석을 기술한다. 마우스는 EV로 두 번 예방 접종을받습니다. 첫 번째 주사 후 십사일 후, T 세포는 비장으로부터 추출되고 유세포 분석기를 통해 IFN-γ 생산을 분석하여 전신 면역 반응을 평가하였다. 이와 함께, 상이한 치료 요법 하에서 출현하는 종양 유래 EVs의 잠재성은 항종양 T 세포 반응을 유도하기 위해 비교적 쉽고, 신속하며, 높은 타당성으로 평가된다¹³. 따라서, 이 방법은 다양한 조건하에서 암 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 스크리닝에 적합하다.

Protocol

실험 개시시, 마우스는 적어도 6주령이었고, 특정 병원체가 없는 조건 하에서 유지되었다. 본 프로토콜은 제도적 윤리 기준과 통용되는 지역 규정을 준수합니다. 동물 연구는 현지 규제 기관 (Regierung von Oberbayern, 독일 뮌헨)의 승인을 받았습니다. 가능한 성 관련 편향은 이들 연구에서 조사되지 않았다. 1. 화학요법 노출 후 종양 세포로부터 유래된 EVs의 생성 및 분리 오?…

Representative Results

이 프로토콜은 종양 유래 EVs의 면역원성의 간단하고 쉽게 재현가능한 평가를 용이하게 하기 위한 것이다. 이에 의해, 마우스는 모델 항원인 닭 난알부민(OVA)을 발현하는 종양 세포의 시험관내 배양물 로부터 유래된 EVs를 접종한다. 후속 면역 반응은 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포에서 분석된다. 그림 1은 전체 프로토콜의 실제 단계에 대…

Discussion

이 프로토콜은 다양한 치료 하에서 다양한 암으로부터 방출되는 EV에 적응하면서 화학요법-유도된 스트레스 하에서 흑색종 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 생체내 평가를 제공한다. 옥살리플라틴-처리된 B16-OVA 세포로부터 유래된 EVs로 마우스를 면역화시키는 것은, 예를 들어, 비장에서 IFN-γ-생산 CD8⁺ T 세포를 확장시키고, 이는 오브알부민을 사용한 생체외 인큐베이션에 ?…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)