ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

Summary

כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.

Abstract

מוות תאי אימונוגני של גידולים, הנגרם על ידי כימותרפיה או הקרנה, יכול לעורר תגובות תאי T ספציפיים לגידול על ידי שחרור דפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה וגרימת הייצור של סוג I אינטרפרון. אימונותרפיות, כולל עיכוב נקודת ביקורת, מסתמכות בעיקר על תאי T קיימים הספציפיים לגידול כדי לפתח אפקט טיפולי. לפיכך, גישות טיפוליות סינרגטיות המנצלות מוות תאי אימונוגני כחיסון אנטי-סרטני מהותי עשויות לשפר את יכולת התגובה שלהן. עם זאת, הספקטרום של גורמים אימונוגניים ששוחררו על ידי תאים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר מאופיין באופן חלקי, במיוחד לגבי שלפוחיות חוץ תאיות (EVs). רכבים חשמליים, חלקיקים מממברניים בקנה מידה ננומטרי הנפלטים כמעט מכל התאים, נחשבים כמקלים על תקשורת בין-תאית, ובסרטן, הוכחו כמתווכים בין-ראשוניים נגד אנטיגנים של גידולים. כדי להעריך את ההשפעה החיסונית של רכבים חשמליים שמקורם בגידולים בתנאים שונים, שיטות הסתגלות, מדרגיות ותקיפות מבוקשות. לכן, כאן מוצגת גישה קלה וחזקה יחסית להערכת האימונוגניות של רכבים חשמליים . הפרוטוקול מבוסס על ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי T טחול לאחר חיסון vivo של עכברים עם רכבים חשמליים, מבודד על ידי בדיקות מבוססות משקעים מתרביות תאים סרטניים תחת טיפול או מצב יציב. לדוגמה, עבודה זו מראה כי חשיפה oxaliplatin של B16-OVA מורין מלנומה תאים הביא לשחרור של רכבים חשמליים אימונוגניים שיכולים לתווך את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים תגובתי הגידול. לפיכך, הקרנה של כלי רכב חשמליים באמצעות חיסון vivo וציטומטריית זרימה מזהה תנאים שבהם כלי רכב חשמליים אימונוגניים יכולים לצאת. זיהוי תנאים של שחרור EV אימונוגני מספק תנאי הכרחי לבדיקת היעילות הטיפולית של רכבים חשמליים נגד סרטן ובחינת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים כדי לחשוף בסופו של דבר תובנות חדשות על תפקידם של כלי רכב חשמליים באימונולוגיה של סרטן.

Introduction

המערכת החיסונית ממלאת תפקיד מרכזי במאבק נגד סרטן, הן כאשר הוא מועלה על ידי עיכוב מחסום חיסוני והן על היעילות של טיפולים קונבנציונליים לסרטן. תאים סרטניים שנכנעים לטיפולים גנוטוקסיים כגון הסוכנים הכימותרפיים אוקסליפלטין ודוקסורוביצין, או טיפול קרינה מייננת יכולים לשחרר אנטיגנים ודפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) שעשויים ליזום תגובה חיסונית נוגדת גידולים ^{הסתגלות1}. ה- DAMPs הבולטים ביותר, בהקשר של מוות תאי אימונוגני, כוללים אותות find-me כגון ATP כימוטקטי, אותות eat-me כגון חשיפת calreticulin, המקדם את ספיגת תאי הגידול על ידי תאים המציגים אנטיגן, ואת שחרורו של HMGB1, המפעיל קולטני זיהוי דפוס, ובכך משפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים ^גידול2. יתר על כן, סוג I אינטרפרונים (IFN-I), המושרה באמצעות חומצות גרעין אימונוגניות שמקורן בגידול או גירויים אחרים, חשים על ידי תאים דנדריטיים, ומאפשרים להם ביעילות ראשונית תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים ^{לגידול3,4}. מבחינה קלינית, תאי CD8⁺ T פעילים ומתרבים החודרים לגידול מספקים גורם פרוגנוסטי עצמאי להישרדות ממושכת בחולי סרטן רבים. שוחרר מתאי T מופעלים כאלה, IFN-γ מתווך השפעות אנטי-פרוליפרטיביות ישירות על תאים סרטניים ומניע את הקיטוב Th1 ובידול תאי T ציטוטוקסיים, ובכך תורם לחיסון יעיל נגד ^סרטן5,6. Oxaliplatin הוא ממריץ מוות תאי אימונוגני בתום לב, מתווך תגובה חיסונית אדפטיבית כזו נגד ^סרטן7. עם זאת, שפע של אותות אימונוגניים ראשוניים שפורסמו על ידי תאים סרטניים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר להיחשף במלואו. למרות התקדמות משמעותית באימונותרפיה של סרטן, הרחבת היתרונות שלה לחלק גדול יותר של חולים נשאר אתגר. הבנה מפורטת יותר של אותות אימונוגניים היוזמים הפעלת תאי T עשויה להנחות את התפתחותם של טיפולים חדשניים.

קבוצה הטרוגנית של מבנים סגורים ממברנה, המכונה שלפוחיות חוץ תאיות (EVs), נראה לשמש התקני תקשורת בין תאיים. רכבים חשמליים הנפלטים כמעט מכל סוגי התאים נושאים חלבונים פונקציונליים, RNA, DNA ומולקולות אחרות לתא נמען או עשויים לשנות את מצבו התפקודי של התא רק על ידי קשירה לקולטנים על פני התא. המטען הפעיל ביולוגית שלהם משתנה באופן משמעותי לפי סוג ומצבו התפקודי של התא ^המפיק8. באימונולוגיה של סרטן, רכבים חשמליים המשתחררים מתאי הגידול נחשבו בעיקר כיריבים לאימונותרפיה מכיוון שהם בסופו של דבר מקדמים צמיחה פולשנית, נישות גרורתיות טרום-צורה9 ומדכאים את התגובה ^{החיסונית10}. לעומת זאת, מספר מחקרים הראו כי רכבים חשמליים יכולים להעביר אנטיגנים של גידולים לתאים דנדריטיים להצגה צולבת ^{יעילה11,12}. רכבים חשמליים עשויים לספק חומצות גרעין אימונוסטימולטוריות אם הם מגיחים תחת לחץ הנגרמת על ידי טיפול, מה שמקל על תגובה חיסונית נגד ^{גידולים13,14}. לאחרונה הוכח כי חישה של ליגנדים חיסוניים מולדים מסוג RNA ודנ”א במיקרו-סביבה של הגידול מווסתת את ההיענות למצור נקודת הביקורת באופן משמעותי ^15,16,17. לפיכך, התפקיד האימונוגני של רכבים חשמליים ששוחררו על ידי תאים סרטניים תחת לחץ טיפולי שונה צריך להיות מובהר עוד יותר. מכיוון שרכבים חשמליים מהווים תחום מחקר צעיר אך צומח, התקינה של השיטות עדיין נמשכת. לכן, שיתוף ידע חיוני כדי לשפר את רבייה המחקר על אינטראקציות בין כלי רכב חשמליים אימונולוגיה סרטן. לאור זאת, כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט להערכת ההשפעה האימונוגנית של רכבים חשמליים שמקורם בגידול ב- vivo.

הערכה זו מתבצעת על ידי יצירת רכבים חשמליים שמקורם בגידול, חיסון עכברי נמענים עם רכבים חשמליים אלה, וניתוח תאי T טחול באמצעות ציטומטריית זרימה. דור EV מבוצע באופן אידיאלי על ידי זריעת תאי גידול מורין במדיום תרבית תאים ללא EV לרמה גבוהה של טוהר. תאים מטופלים עם גירוי סטרס תאי ספציפי, כגון כימותרפיה, כדי להשוות את ההשפעה של רכבים חשמליים הנגרמים על ידי טיפול נגד אימונוגניות בסיסית של רכבים חשמליים שמקורם בגידול בהתאמה. בידוד של רכבים חשמליים עשוי להתבצע בהחלט על ידי טכניקות שונות שיש לבחור על פי תחולת vivo וזמינות מקומית. הפרוטוקול הבא מתאר בדיקה מבוססת משקעים עם ערכה מסחרית לטיהור EV. עכברים מחוסנים פעמיים עם הרכבים החשמליים האלה. 14 ימים לאחר הזריקה הראשונה, תאי T מופקים מהטחול ומנותחים לייצור IFN-γ באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך תגובה חיסונית מערכתית. עם זאת, הפוטנציאל של רכבים חשמליים שמקורם בגידול, המתעוררים תחת משטרים טיפוליים שונים, כדי לגרום לתגובות תאי T אנטי סרטניים מוערך בקלות יחסית, במהירות, ועם תוקף ^גבוה13. לכן, שיטה זו מתאימה להקרנה אימונולוגית של רכבים חשמליים שמקורם בתאים סרטניים בתנאים שונים.

Protocol

בתחילת הניסויים, עכברים היו לפחות 6 שבועות של גיל נשמרו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. הפרוטוקול הנוכחי עומד בסטנדרטים האתיים המוסדיים ובתקנות המקומיות השוררות. מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הסוכנות הרגולטורית המקומית (Regierung von Oberbayern, מינכן, גרמניה). הטיות אפשריות הקשורות למין לא נחקרו במחקרי…

Representative Results

פרוטוקול זה נועד להקל על הערכה פשוטה וקלה לשחזור של האימונוגניות של רכבים חשמליים שמקורם בגידול. בזאת, עכברים מחוסנים עם רכבים חשמליים הנגזרים מתרביות הפריה חוץ גופית של תאים סרטניים המבטאים את המודל אנטיגן עוף ovalbumin (OVA). התגובה החיסונית הבאה מנותחת בתאי T טחול באמצעות ציטומטריי?…

Discussion

פרוטוקול זה מספק הערכה אימונולוגית של vivo של כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מלנומה תחת לחץ הנגרמת על ידי כימותרפיה תוך הסתגלות לרכבים חשמליים הנפלטים מסרטן שונים תחת טיפולים שונים. חיסון עכברים עם רכבים חשמליים המופקים מתאי B16-OVA שטופלו באוקסליפלטין, למשל, מרחיב את תאי CD8⁺ T המייצרים …

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)