Velkarakteriserede genetiske dele er nødvendige for design af nye genetiske kredsløb. Her beskriver vi en omkostningseffektiv, high-throughput metode til hurtig karakterisering af genetiske dele. Vores metode reducerer omkostninger og tid ved at kombinere cellefrie lysater, lineært DNA for at undgå kloning og akustisk væskehåndtering for at øge gennemstrømningen og reducere reaktionsvolumenerne.
Karakterisering og katalogisering af genetiske dele er afgørende for design af nyttige genetiske kredsløb. At have velkarakteriserede dele giver mulighed for finjustering af genetiske kredsløb, således at deres funktion resulterer i forudsigelige resultater. Med væksten af syntetisk biologi som felt har der været en eksplosion af genetiske kredsløb, der er blevet implementeret i mikrober for at udføre funktioner vedrørende sensing, metabolisk ændring og cellulær computing. Her viser vi en hurtig og omkostningseffektiv metode til karakterisering af genetiske dele. Vores metode anvender cellefrit lysat, der fremstilles internt som et medium til at evaluere dele via ekspression af et reporterprotein. Skabelon-DNA fremstilles ved PCR-amplifikation ved hjælp af billige primere for at tilføje variantdele til reportergenet, og skabelonen føjes til reaktionen som lineært DNA uden kloning. Dele, der kan tilføjes på denne måde, inkluderer promotorer, operatører, ribosombindingssteder, isolatorer og terminatorer. Denne tilgang kombineret med inkorporeringen af en akustisk væskehåndtering og 384-brøndplader giver brugeren mulighed for at udføre high-throughput evalueringer af genetiske dele på en enkelt dag. Til sammenligning kræver cellebaserede screeningsmetoder tidskrævende kloning og har længere testtider på grund af normaliseringstrin for kultur natten over og kulturtæthed. Endvidere giver arbejde i cellefri lysat brugeren mulighed for at opnå strammere kontrol over ekspressionsbetingelserne gennem tilsætning af eksogene komponenter og DNA ved præcise koncentrationer. Resultater opnået ved cellefri screening kan bruges direkte i applikationer af cellefrie systemer eller i nogle tilfælde som en måde at forudsige funktion i hele celler.
En kerneindsats inden for syntetisk biologi er at udvikle genetiske værktøjssæt, der indeholder velkarakteriserede dele, som kan bruges til at konstruere genetiske kredsløb1, der udfører nyttige funktioner, når de indsættes i mikrober eller cellefrie lysater. Områder, hvor sådanne genetiske kredsløb har fået trækkraft, registrerer 2,3,4, menneskelig ydeevne 5,6, biobrændstoffer7,8, materialeproduktion 9,10 og cellulær computing 11. Registre over standardiserede genetiske dele er blevet oprettet12 for at katalogisere nye og eksisterende dele i kategorier som promotorer, operatører, kodende sekvenser og terminatorer, for blot at nævne nogle få. Bestræbelser som iGEM (international Genetic Engineered Machines) konkurrence13 har været medvirkende til at karakterisere og katalogisere disse genetiske dele. Mange metoder er blevet udviklet for at lette hurtig samling af disse dele i nyttige genetiske kredsløb14,15. Software er endda udviklet til at automatisere sammensætningen af velkarakteriserede dele til kredsløb, der opnår en ønsket funktion16. Samlingen af nyttige genetiske kredsløb med forudsigelige funktioner hviler imidlertid på formodningen om, at de genetiske værktøjssæt indeholder velkarakteriserede genetiske dele. På grund af nødvendigheden af disse værktøjssæt mod fremskridt inden for syntetisk biologi er adskillige bestræbelser på bedre at katalogisere kredsløb og dele med passende karakteriseringsdata blevet beskrevet 17,18,19,20,21.
En tilgang til karakterisering af genetiske komponenter gør brug af cellefri proteinsyntese (CFPS) systemer, som rekonstituerer cellulære funktioner såsom transkription og translation ex vivo22. Flere undersøgelser har vist CFPS’ potentiale til prototypning af genetiske komponenter 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, hvad enten det er til direkte anvendelse i cellefrie systemer eller til at forudsige funktionen af genetiske konstruktioner i celler, såsom den relative aktivitet af dele i et bibliotek 29 , optimering af metabolisk vej27 og cellulær byrde30. Fordele ved prototyping i CFPS versus celler fremhævet af disse undersøgelser inkluderer at undgå tidskrævende kloning, præcis kontrol over koncentrationen af DNA og andre reaktionskomponenter og evnen til let at blande og matche flere DNA-konstruktioner. Fordelen ved at undgå kloning er især tydelig ved brug af lineære DNA-skabeloner, som gør det muligt at samle nye konstruktioner ved in vitro-metoder, der tager timer i stedet for dage33. Evnen til at manipulere koncentrationen af DNA-konstruktioner og andre komponenter blot ved pipettering gør tilgangen endnu mere attraktiv ved at muliggøre eksperimenter med høj kapacitet drevet af væskehåndteringsrobotter34,35. Mens succeser med at bruge CFPS til prototyping er blevet rapporteret, er det vigtigt at bemærke, at det stadig er at se, under hvilke sammenhænge CFPS-resultater pålideligt kan forudsige funktionalitet i celler.
Her præsenterer vi en metode til CFPS-prototyping, der understreger fordelene i hastighed, gennemstrømning og omkostninger sammenlignet med traditionelle cellebaserede tilgange. Tilgangen stammer fra vores tidligere arbejde, hvor vi brugte CFPS til hurtigt at karakterisere et bibliotek af T7-promotorvarianter reguleret af transkriptionsfaktoren TetR32, hvilket signifikant udvidede den lille håndfuld regulerede T7-promotorvarianter, der var tilgængelige i litteraturen på det tidspunkt36,37. Andre har siden da udvidet udvalget af sådanne initiativtagere yderligere38. I vores metode accelereres genetisk konstruktion ved at bruge PCR til at amplificere skabelon-DNA via primere, der tilføjer variantgenetiske dele til et reportergen. Akustisk væskehåndtering i plader med 384 brønde bruges til at øge gennemstrømningen og reducere mængden af nødvendige materialer. Tidligere arbejde har vist vellykket brug af akustisk væskehåndtering ved betydeligt lavere volumener39,40 med variabilitet, der kan sammenlignes med manuel pipettering af større volumener 41. Ud over metoden leverer vi fejlfindingsoplysninger og en vurdering af potentielle omkostnings- og tidsbesparelser. Bemærk, at selvom vi inkluderer en protokol til fremstilling af cellefrie lysater baseret på Sun et al.42 her, bør mange andre kommercielle sæt og protokoller43,44 også fungere. Tilsvarende, mens vi demonstrerer metoden til karakterisering af promotorvarianter32, kan andre dele udskiftes ved PCR-amplifikation, såsom riboregulatorer, ribosombindingssteder (RBS’er), isolatorer, proteinmærker og terminatorer. Vi håber, at denne metode kan hjælpe det syntetiske biologisamfund med at fortsætte med at vokse antallet af karakteriserede dele til samling af forudsigelige genetiske kredsløb med nyttig funktion.
De her beskrevne protokoller giver et omkostningseffektivt og hurtigt middel til at screene genetiske dele via ekspression af et reporterprotein ved CFPS. Velkarakteriserede genetiske dele er afgørende for udformningen af forudsigelige genetiske kredsløb med nyttig funktion. Denne metode øger gennemstrømningen og reducerer den tid, der er nødvendig for at screene nye genetiske dele ved at fjerne kravet om at arbejde i levende celler, samtidig med at funktionaliteten, der afspejler det cellulære miljø ved at bevare den metaboliske proces med proteinekspression i cellelysatet, bevares. Vores protokol kan udføres på 1 dag efter modtagelse af primere (~ 2,5-6 timer til reaktionsforberedelse, 2-16 timer til CFPS-reaktion; Figur 1) sammenlignet med mindst 3 dage for traditionel kloning (1 dag hver for konstruktionssamling og transformation, sekvensverifikation af kloner og dyrkning af celler til vurdering). Vi vurderer endvidere, at omkostningerne pr. konstruktion ved hjælp af lineært DNA er omtrent en tredjedel af den traditionelle kloning ($ 78 vs. $ 237; Supplerende tabel 1) metoder. Kommercielle syntesetjenester citerer i øjeblikket mindst 4 arbejdsdage afhængigt af størrelse, selvom de ville have lignende omkostninger som vores metode, hvis lineære fragmenter screenes direkte i CFPS ($ 78 vs. $ 91); Vi har ikke verificeret denne tilgang. Omkostningerne ved at evaluere en del med CFPS er små sammenlignet med genereringen af skabelon-DNA’et ($ 0,05 / reaktion22 vs. $ 78 pr. Skabelon), selvom det skal bemærkes, at opstartsomkostningerne for bulkreagenser og lysisudstyr er mindst flere tusinde dollars. Brugen af en akustisk væskebehandler forbedrer kun omkostningerne marginalt ved at muliggøre mindre volumener ned til 0,5 μL40; Den mere signifikante fordel er reduktionen af tid til at forberede reaktioner (~ 10 min vs. op til 1 time, afhængigt af antallet af reaktioner), især når man forbereder et stort antal reaktioner, giver anledning til bekymring for forberedt reaktion, der sidder i længere tid før inkubation.
Selvom CFPS-prototyper er hurtige og omkostningseffektive, er der stadig uvisse, når CFPS-prototyper forudsiger in vivo-funktionen tilstrækkeligt. For eksempel vil krydsreaktivitet med genomisk DNA ikke blive detekteret på grund af fjernelse af værtsgenomet under produktionen af CFPS-systemet. Komponentkoncentrationer kan også være 1-2 størrelsesordener lavere i CFPS end i celle51, hvilket sandsynligvis vil påvirke opførelsen af nogle dele som følge af forskellige makromolekylære trængselsforhold. Endvidere kan lineært DNA’s evne til at forudsige in vivo-funktion være begrænset, for eksempel når DNA’s sekundære struktur spiller en vigtig rolle. En sidste begrænsning er, at konstruktioner ikke sekvensverificeres før test for funktioner. Der kan være tilfælde, hvor den karakteriserede del faktisk ikke er tilpasset den tilsigtede teoretiske rækkefølge. Alle disse begrænsninger kan afhjælpes ved at validere en delmængde af de dele, der screenes ved denne metode i den tilsigtede in vivo-applikation .
Vi udviklede oprindeligt denne metode til at undersøge virkningerne af at ændre operatørpositionen på hybrid T7-tetO-promotorer 32. Vi har præsenteret protokollerne her i et mere generisk format, så de kan anvendes på promotorer, operatører, ribosombindingssekvenser, isolatorer og terminatorer. Disse genetiske dele kan tilføjes til 5′- eller 3′-enden af reportergenet ved PCR ved hjælp af primere til hvert design, hvilket eliminerer behovet for syntese eller kloning af hver variant for at teste. De resulterende PCR-produkter tjener som skabelon-DNA til evaluering via ekspression af et reporterprotein. I vores arbejde blev affinitetsrensningsprotokollen, der er angivet her, brugt til TetR og GamS. Den samme procedure kan anvendes til ekspression og oprensning af andre repressorer, aktivatorer, polymeraser, sigmafaktorer og andre proteiner, der er beslægtede med en genetisk del af interesse, selvom modifikationer kan være nødvendige for det ønskede protein, der udtrykkes. Oprensning og titrering af disse proteiner i CFPS-reaktioner muliggør en mere detaljeret karakterisering af en bestemt genetisk del. Endelig findes der talrige alternative CFPS-protokoller, som hver især bør kunne anvendes til delscreeningsdelen af metodologien. Som et eksempel inkluderer vi ikke et dialysetrin i denne protokol, som andre har fundet vigtigt for ekspression fra indfødte bakteriepromotorer22. Det er også muligt at variere koncentrationerne af de underliggende bestanddele af den fælles fiskeripolitik. Brugen af væskehåndtering forbedrer evnen til at teste de utallige forhold ved at øge gennemstrømningen og reducere de krævede materialer34,35.
Et område, der kan kræve betydelig fejlfinding, er optimering af den akustiske væskehåndterer. Dispensering af akustisk væskehåndterer bør optimeres for hver komponent, der overføres, og det anbefales kraftigt at køre kontroller for at verificere korrekt fordeling og reproducerbarhed, før der indsamles data. Den ideelle kildepladetype og væskeklasseindstilling afhænger af den specifikke væske, der skal dispenseres, og dens komponenter. Det anbefales ikke at bruge aminbelagte plader til at dispensere DNA, da aminbelægningen kan interagere med DNA’et. Det skal også bemærkes, at evnen til at dispensere højere koncentrationer af visse komponenter kan afhænge af den akustiske væskehåndteringsmodel. En testvæskeoverførsel kan udføres ved dispensering på en foliepladeforsegling for at visualisere vellykket dråbedannelse; Denne test giver dog begrænsede oplysninger, og slipværktøjer fra forskellige indstillinger kan se identiske ud. Brugen af et vandopløseligt farvestof, såsom tartrazin, kan bruges til mere nøjagtigt at kontrollere, at det korrekte volumen dispenseres med en given indstilling eller arbejdsgang (se Repræsentative resultater). Optimal programmering af likvide overførsler kan også påvirke nøjagtigheden og konsistensen af de genererede data; for overførsler >1 μL fra en kildebrønd til en destinationsbrønd har vi konstateret, at sekventielle overførsler på ≤1 μL bør programmeres til at reducere systematisk brønd-til-brønd-variabilitet (figur 4). Endelig kan teoretiske og faktiske kildebrønddøde volumener variere dramatisk afhængigt af kildepladetypen, væskeklasseindstillingen og komponenterne i den specifikke væske; Brug af Acoustic Liquid Handler Survey-funktionen til at vurdere brøndvolumenerne, før du kører et program, kan hjælpe med at måle, hvor nøjagtigt instrumentet er i stand til at måle en bestemt væske.
CFPS-reaktionsydelsen kan variere, når resultater sammenlignes mellem forskellige brugere, materialebatcher, pladelæsere og laboratorier41. I tilfælde, hvor sådanne sammenligninger er nødvendige under prototyper af genetiske kredsløb, anbefaler vi at inkludere interne kontrolreaktioner med standardkonstitutive promotorer i hver reaktionsplade for at hjælpe med at normalisere resultaterne på tværs af eksperimentelle opsætninger. Metoden til DNA-forberedelse kan også bidrage væsentligt til CFPS-aktivitet; Det anbefales at medtage et ethanoludfældningstrin. Derudover kan den optimale reaktionssammensætning variere med batchen af ekstrakt34. Især optimale magnesiumglutamat- og kaliumglutamatkoncentrationer har vist sig at variere efter batch42 eller med det anvendte promotor- eller reporterprotein24. Koncentrationerne af disse komponenter bør optimeres ved screening på tværs af flere koncentrationer af hver komponent pr. genetisk konstruktion og pr. celleekstraktpræparat for at bestemme de optimale betingelser for proteinekspression. Endelig omfatter bedste praksis for ensartet CFPS-reaktionsydelse grundig blanding, omhyggelig pipettering og konsistens i fremstillingen af hver reagenskomponent.
Ud over karakterisering af individuelle dele kan den samme metode bruges til at screene kombinationer af dele, der danner komplekse kredsløb, såsom logiske kredsløb16 eller oscillatorer52,53. Denne metode kan også anvendes til screening og optimering af biosensorer til applikationer inden for epidemiologisk diagnostik 54,55,56,57 eller faredetektion og kvantificering 3,58,59. Anvendelsen af AI-drevne teknikker såsom aktiv læring34 kan også parres med denne metodes høje kapacitet til at drive hurtig udforskning af komplekse biologiske designrum. I sidste ende forestiller vi os, at denne tilgang understøtter accelererede udviklingstider for nye genetiske designs inden for syntetisk biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev muliggjort af forsvarsministerens kontor for anvendt forskning til fremme af videnskab og teknologi prioriteter program. Vi takker Scott Walper (Naval Research Laboratory) for at levere lageret af anvendt sfGFP og Zachary Sun og Abel Chiao (Tierra Biosciences) for frugtbare diskussioner relateret til prototyping med cellefrie systemer og relateret fejlfinding af akustisk væskehåndtering.
2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y2377-250G | Alternative to making 2xYT media |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | S30 Buffer B |
Agar | Bacto | 214010 | For plating cells |
Chromatography column (5 cm diameter) | BIO-RAD | 731-1550 | Used for protein purification. |
Destination plate | Thermo Scientific Nunc plate | 142761 | For CFPS reactions |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | For dialysis buffer |
DpnI | NEB | R0176L | For digestion of plasmid templates |
DTT | Roche | 20871723 | S30 Buffer B |
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 | Novagen | 70954 | Cell line used for production of lysate and purified proteins |
Echo acoustic liquid handler | Labcyte | 525 | Acoustic liquid handler |
French pressure cell | Thermo Spectronic | FA-078 | For lysing cells for CFPS |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | For buffers |
Impermeable plastic sealable lid | Thermo | 232702 | Plate seal |
IPTG | RPI | I56000-25.0 | Used for protein induction. |
K-Glu | Sigma-Aldrich | g1501-500G | S30 Buffer B |
Labcyte Echo source plate | Labcyte | PL-05525 | For use with Echo acoustic liquid handler |
Mg-Glu | Sigma-Aldrich | 49605-250G | S30 Buffer B |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-250G | For buffers |
NaHPO4 | Sigma-Aldrich | 71505 | For dialysis buffer |
NaOH | Mallinckrodt Chemicals | 7708-10 | For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899 |
Ni-NTA resin | Invitrogen | R901-15 | For production of purified proteins |
PCR H2O | Ambion | AM9937 | PCR of linear templates |
Plate Reader | BioTek | H10 | Plate reader used |
Q5 PCR Master Mix | NEB | M0494S | PCR of linear templates |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28606 | PCR of linear templates |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR of linear templates |
QSonica Ultrasonic Processor | Qsonica | Q700 | Cell disruption during protein purification |
RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | Updated supplier from Sun et al. |
Tris | MP | 819623 | S30 Buffer B |
Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | For buffers |
Tryptone | Fluka | T7293 | For making 2xYT media |
Yeast Extract | Bacto | 212750 | For making 2xYT media |