Хорошо охарактеризованные генетические части необходимы для разработки новых генетических схем. Здесь мы описываем экономически эффективный, высокопроизводительный метод быстрой характеристики генетических частей. Наш метод сокращает затраты и время за счет объединения бесклеточных лизатов, линейной ДНК, чтобы избежать клонирования, и обработки акустической жидкости для увеличения пропускной способности и уменьшения объемов реакции.
Характеристика и каталогизация генетических частей имеют решающее значение для разработки полезных генетических схем. Наличие хорошо охарактеризованных частей позволяет точно настроить генетические схемы, так что их функция приводит к предсказуемым результатам. С ростом синтетической биологии как области произошел взрыв генетических схем, которые были реализованы в микробах для выполнения функций, относящихся к зондированию, метаболическим изменениям и клеточным вычислениям. Здесь мы показываем быстрый и экономически эффективный метод характеристики генетических частей. Наш метод использует бесклеточный лизат, приготовленный собственными силами в качестве среды для оценки частей посредством экспрессии репортерного белка. Шаблон ДНК получают путем амплификации ПЦР с использованием недорогих праймеров для добавления вариантных частей к репортерскому гену, а шаблон добавляют в реакцию в виде линейной ДНК без клонирования. Части, которые могут быть добавлены таким образом, включают промоутеры, операторы, сайты связывания рибосом, изоляторы и терминаторы. Такой подход в сочетании с включением акустического жидкостного погрузчика и плит на 384 скважины позволяет пользователю проводить высокопроизводительные оценки генетических деталей за один день. Для сравнения, клеточные подходы к скринингу требуют трудоемкого клонирования и имеют более длительное время тестирования из-за ночных этапов нормализации культуры и плотности культуры. Кроме того, работа в бесклеточном лизате позволяет пользователю более жестко контролировать условия экспрессии путем добавления экзогенных компонентов и ДНК в точных концентрациях. Результаты, полученные в результате бесклеточного скрининга, могут быть использованы непосредственно в приложениях бесклеточных систем или, в некоторых случаях, как способ прогнозирования функции в целых клетках.
Основные усилия синтетической биологии заключаются в разработке наборов генетических инструментов, содержащих хорошо охарактеризованные части, которые могут быть использованы для построения генетических схем1, которые выполняют полезные функции при развертывании в микробах или бесклеточных лизатах. Области, в которых такие генетические схемы набрали обороты: зондирование 2,3,4, производительность человека 5,6, биотопливо 7,8, производство материалов 9,10 и клеточные вычисления11. Реестры стандартизированных генетических частей были созданы12 для каталогизации новых и существующих частей по категориям, таким как промоутеры, операторы, кодирующие последовательности и терминаторы, и это лишь некоторые из них. Такие усилия, как iGEM (международный конкурс генетически модифицированных машин)13, сыграли важную роль в характеристике и каталогизации этих генетических частей. Было разработано много методов, облегчающих быструю сборку этих деталей в полезные генетическиесхемы 14,15. Программное обеспечение даже было разработано для автоматизации композиции хорошо охарактеризованных частей в схемы, которые достигают желаемой функции16. Однако сборка полезных генетических схем с предсказуемыми функциями основывается на предположении, что наборы генетических инструментов содержат хорошо охарактеризованные генетические части. Из-за необходимости этих наборов инструментов для развития синтетической биологии были описаны многочисленные усилия по улучшению каталогизации схем и деталей с соответствующими характеристиками 17,18,19,20,21.
Один из подходов к характеристике генетических компонентов использует бесклеточные системы синтеза белка (CFPS), которые воссоздают клеточные функции, такие как транскрипция и трансляция ex vivo22. Несколько исследований продемонстрировали потенциал CFPS для прототипирования генетических компонентов 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, будь то для прямого применения в бесклеточных системах или для прогнозирования функции генетических конструкций в клетках, таких как относительная активность частей в библиотеке 29 , оптимизация метаболического пути27 и клеточной нагрузки30. Преимущества прототипирования в CFPS по сравнению с клетками, подчеркнутые этими исследованиями, включают в себя избежание трудоемкого клонирования, точный контроль над концентрацией ДНК и других компонентов реакции и способность легко смешивать и сопоставлять несколько конструкций ДНК. Преимущество избегания клонирования особенно очевидно при использовании линейных шаблонов ДНК, что позволяет собирать новые конструкции методами in vitro, которые занимают часы вместо33 дней. Возможность манипулировать концентрацией конструкций ДНК и других компонентов просто путем пипетирования делает этот подход еще более привлекательным, позволяя проводить эксперименты с высокой пропускной способностью на основе роботов для обработки жидкостей34,35. Хотя сообщалось об успехах использования CFPS для прототипирования, важно отметить, что еще предстоит увидеть, в каких контекстах результаты CFPS могут надежно предсказать функциональность в клетках.
Здесь мы представляем метод прототипирования CFPS, который подчеркивает преимущества в скорости, пропускной способности и стоимости по сравнению с традиционными подходами на основе ячеек. Этот подход основан на нашей предыдущей работе, где мы использовали CFPS для быстрой характеристики библиотеки вариантов промотора T7, регулируемых фактором транскрипции TetR32, значительно расширяя небольшую горстку регулируемых вариантов промотора T7, которые были доступны в литературе в то время36,37. С тех пор другие еще больше расширили круг таких промоутеров38. В нашем методе сборка генетической конструкции ускоряется с помощью ПЦР для амплификации шаблонной ДНК с помощью праймеров, которые добавляют вариантные генетические части к гену-репортеру. Акустическая обработка жидкости в 384-скважинных плитах используется для увеличения пропускной способности и уменьшения объема необходимых материалов. Предыдущая работа продемонстрировала успешное использование акустической обработки жидкостей при значительно меньших объемах39,40 с изменчивостью, сопоставимой с ручным пипетированием больших объемов41. В дополнение к методу, мы предоставляем информацию об устранении неполадок и оценку потенциальных затрат и экономии времени. Обратите внимание, что, хотя мы включаем здесь протокол для производства бесклеточных лизатов на основе Sun et al.42, многие другие коммерческие наборы и протоколы43,44 также должны работать. Аналогичным образом, в то время как мы демонстрируем метод характеристики вариантовпромотора 32, другие части могут быть заменены амплификацией ПЦР, такие как риборегуляторы, сайты связывания рибосом (RBS), изоляторы, белковые метки и терминаторы. Мы надеемся, что эта методология может помочь сообществу синтетической биологии продолжать увеличивать количество характерных деталей для сборки предсказуемых генетических цепей с полезной функцией.
Протоколы, описанные здесь, обеспечивают экономически эффективные и быстрые средства для скрининга генетических частей посредством экспрессии репортерного белка CFPS. Хорошо охарактеризованные генетические части имеют решающее значение для разработки предсказуемых генетических схем с полезной функцией. Эта методология увеличивает пропускную способность и уменьшает время, необходимое для скрининга новых генетических частей, устраняя необходимость работы в живых клетках, сохраняя при этом функциональность, которая отражает клеточную среду, сохраняя метаболический процесс экспрессии белка в клеточном лизате. Наш протокол может быть выполнен через 1 день после приема праймеров (~2,5-6 ч для приготовления реакции, 2-16 ч для реакции CFPS; Рисунок 1), по сравнению с по меньшей мере 3 днями для традиционного клонирования (по 1 дню для сборки и преобразования конструкций, проверки последовательности клонов и культивирования клеток для оценки). Мы также оцениваем, что стоимость одной конструкции с использованием линейной ДНК составляет примерно одну треть традиционного клонирования (78 долларов США против 237 долларов США; Дополнительная таблица 1) методика. Коммерческие услуги синтеза в настоящее время котируют минимум 4 рабочих дня в зависимости от размера, хотя они будут иметь аналогичные затраты, чем наш метод, если линейные фрагменты будут отсеиваться непосредственно в CFPS ($78 против $91); мы не проверили этот подход. Стоимость оценки детали с CFPS невелика по сравнению с генерацией ДНК шаблона ($ 0,05 / реакция22 против $ 78 за шаблон), хотя следует отметить, что затраты на запуск объемных реагентов и лизисного оборудования составляют не менее нескольких тысяч долларов. Использование акустического жидкостного погрузчика лишь незначительно снижает затраты, позволяя уменьшить объемы до 0,5 мкл40; более существенным преимуществом является сокращение времени на подготовку реакций (~10 мин против 1 ч, в зависимости от количества реакций), особенно при подготовке большого количества реакций вызывает опасения по поводу подготовленной реакции, сидящей в течение длительного времени перед инкубацией.
Несмотря на быстроту и экономическую эффективность, ограничения на то, когда прототипирование CFPS адекватно предсказывает функцию in vivo , еще предстоит увидеть. Например, любая перекрестная реактивность с геномной ДНК не будет обнаружена из-за удаления генома хозяина во время производства системы CFPS. Кроме того, концентрации компонентов могут быть на 1-2 порядка ниже в CFPS, чем в клетках51, что, вероятно, повлияет на поведение некоторых частей в результате различных условий макромолекулярной скученности. Кроме того, способность линейной ДНК предсказывать функцию in vivo может быть ограничена, например, когда вторичная структура ДНК играет важную роль. Последнее ограничение заключается в том, что конструкции не проверяются последовательностью перед тестированием функций. Могут быть случаи, когда характеризуемая часть фактически не соответствует предполагаемой теоретической последовательности. Все эти ограничения могут быть смягчены путем проверки подмножества деталей, экранированных этим методом, в предполагаемом приложении in vivo .
Первоначально мы разработали эту методологию для исследования влияния изменения положения оператора на гибридные промоторы T7-tetO 32. Мы представили протоколы здесь в более общем формате, так что они могут быть применены к промоторам, операторам, последовательностям связывания рибосом, изоляторам и терминаторам. Эти генетические части могут быть добавлены к 5ʹ или 3ʹ концу репортерного гена с помощью ПЦР с использованием праймеров для каждой конструкции, устраняя необходимость синтеза или клонирования каждого варианта для тестирования. Полученные продукты ПЦР служат шаблонной ДНК для оценки через экспрессию репортерного белка. В нашей работе для TetR и GamS использовался приведенный здесь протокол аффинной очистки. Та же процедура может быть использована для экспрессии и очистки других репрессоров, активаторов, полимераз, сигма-факторов и других белков, родственных генетической части, представляющей интерес, хотя для экспрессии желаемого белка могут потребоваться модификации. Очистка и титрование этих белков в реакции CFPS позволяет более детально охарактеризовать конкретную генетическую часть. Наконец, существует множество альтернативных протоколов CFPS, и каждый из них должен поддаваться части методологии, касающейся скрининга частей. В качестве примера мы не включаем в этот протокол этап диализа, который, по мнению других, важен для экспрессии из нативных бактериальных промоторов22. Также возможно изменение концентраций основных составляющих компонентов CFPS. Использование обработки жидкостей повышает способность тестировать множество условий за счет увеличения пропускной способности и уменьшения требуемых материаловна 34,35.
Одной из областей, которая может потребовать значительного устранения неполадок, является оптимизация акустического обработчика жидкостей. Акустическое дозирование жидкости должно быть оптимизировано для каждого передаваемого компонента, и настоятельно рекомендуется запустить средства управления для проверки правильного распределения и воспроизводимости перед сбором данных. Идеальный тип исходной пластины и класс жидкости будут зависеть от конкретной жидкости, которая будет дозироваться, и ее компонентов. Не рекомендуется использовать пластины с аминным покрытием для дозирования ДНК, так как аминное покрытие может взаимодействовать с ДНК. Следует также отметить, что способность дозировать более высокие концентрации определенных компонентов может зависеть от модели акустической жидкости. Перенос испытательной жидкости может проводиться путем дозирования на уплотнение фольгированной пластины для визуализации успешного образования капель; однако этот тест предоставляет ограниченную информацию, и капли из разных настроек могут выглядеть одинаково. Использование водорастворимого красителя, такого как тартразин, может быть использовано для более точной проверки того, что правильный объем обходится без заданной настройки или рабочего процесса (см. Репрезентативные результаты). Оптимальное программирование переноса жидкости также может влиять на точность и согласованность генерируемых данных; для переноса >1 мкл из одной исходной скважины в одну скважину назначения мы обнаружили, что последовательные переносы ≤1 мкл должны быть запрограммированы для снижения систематической изменчивости скважины к скважине (рисунок 4). Наконец, теоретические и фактические объемы мертвых скважин могут резко варьироваться в зависимости от типа исходной пластины, настроек класса жидкости и компонентов конкретной жидкости; использование функции обследования акустической жидкости для оценки объемов скважины перед запуском программы может помочь оценить, насколько точно прибор способен измерять конкретную жидкость.
Эффективность реакции CFPS может варьироваться при сравнении результатов между различными пользователями, партиями материалов, считывателями пластин и лабораториями41. Для случаев, когда такие сравнения необходимы при прототипировании генетических схем, мы рекомендуем включать реакции внутреннего контроля со стандартными конститутивными промоторами в каждую реакционную пластину, чтобы помочь нормализовать результаты в экспериментальных установках. Метод получения ДНК также может в значительной степени способствовать активности CFPS; рекомендуется включить стадию осаждения этанола. Кроме того, оптимальный реакционный состав может варьироваться в зависимости от партии экстракта34. Было показано, что оптимальные концентрации глутамата магния и глутамата калия, в частности, варьируются в зависимости от партии42 или от используемого промоторного или репортерного белка24. Концентрации этих компонентов должны быть оптимизированы путем скрининга нескольких концентраций каждого компонента на генетическую конструкцию и на препарат экстракта клетки для определения оптимальных условий экспрессии белка. Наконец, наилучшие методы обеспечения стабильной реакционной реакции CFPS включают тщательное перемешивание, тщательное дозирование и консистенцию при приготовлении каждого компонента реагента.
Помимо характеристик отдельных частей, тот же метод может быть использован для экранирования комбинаций деталей, которые образуют сложные схемы, такие как логические схемы16 или генераторы 52,53. Этот метод также может быть применен для скрининга и оптимизации биосенсоров для применения в эпидемиологической диагностике 54,55,56,57 или обнаружении и количественной оценке опасности 3,58,59. Применение методов, управляемых ИИ, таких как активное обучение34, также может сочетаться с высокопроизводительным характером этого метода для быстрого исследования сложных биологических пространств проектирования. В конечном счете, мы предполагаем, что этот подход поддерживает ускоренное время разработки новых генетических конструкций в синтетической биологии.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа стала возможной благодаря программе прикладных исследований Управления министра обороны по продвижению приоритетов в области науки и техники. Мы благодарим Скотта Уолпера (Военно-морская исследовательская лаборатория) за предоставление запасов использованного sfGFP, а также Закари Сана и Абеля Чиао (Tierra Biosciences) за плодотворные дискуссии, связанные с прототипированием бесклеточных систем и связанными с этим устранением неполадок при обработке акустических жидкостей.
2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y2377-250G | Alternative to making 2xYT media |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | S30 Buffer B |
Agar | Bacto | 214010 | For plating cells |
Chromatography column (5 cm diameter) | BIO-RAD | 731-1550 | Used for protein purification. |
Destination plate | Thermo Scientific Nunc plate | 142761 | For CFPS reactions |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | For dialysis buffer |
DpnI | NEB | R0176L | For digestion of plasmid templates |
DTT | Roche | 20871723 | S30 Buffer B |
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 | Novagen | 70954 | Cell line used for production of lysate and purified proteins |
Echo acoustic liquid handler | Labcyte | 525 | Acoustic liquid handler |
French pressure cell | Thermo Spectronic | FA-078 | For lysing cells for CFPS |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | For buffers |
Impermeable plastic sealable lid | Thermo | 232702 | Plate seal |
IPTG | RPI | I56000-25.0 | Used for protein induction. |
K-Glu | Sigma-Aldrich | g1501-500G | S30 Buffer B |
Labcyte Echo source plate | Labcyte | PL-05525 | For use with Echo acoustic liquid handler |
Mg-Glu | Sigma-Aldrich | 49605-250G | S30 Buffer B |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-250G | For buffers |
NaHPO4 | Sigma-Aldrich | 71505 | For dialysis buffer |
NaOH | Mallinckrodt Chemicals | 7708-10 | For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899 |
Ni-NTA resin | Invitrogen | R901-15 | For production of purified proteins |
PCR H2O | Ambion | AM9937 | PCR of linear templates |
Plate Reader | BioTek | H10 | Plate reader used |
Q5 PCR Master Mix | NEB | M0494S | PCR of linear templates |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28606 | PCR of linear templates |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR of linear templates |
QSonica Ultrasonic Processor | Qsonica | Q700 | Cell disruption during protein purification |
RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | Updated supplier from Sun et al. |
Tris | MP | 819623 | S30 Buffer B |
Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | For buffers |
Tryptone | Fluka | T7293 | For making 2xYT media |
Yeast Extract | Bacto | 212750 | For making 2xYT media |