Välkarakteriserade genetiska delar är nödvändiga för design av nya genetiska kretsar. Här beskrivs en kostnadseffektiv metod med hög genomströmning för att snabbt karakterisera genetiska delar. Vår metod minskar kostnad och tid genom att kombinera cellfria lysater, linjärt DNA för att undvika kloning och akustisk vätskehantering för att öka genomströmningen och minska reaktionsvolymerna.
Att karakterisera och katalogisera genetiska delar är avgörande för utformningen av användbara genetiska kretsar. Att ha välkarakteriserade delar möjliggör finjustering av genetiska kretsar, så att deras funktion resulterar i förutsägbara resultat. Med tillväxten av syntetisk biologi som ett fält har det skett en explosion av genetiska kretsar som har implementerats i mikrober för att utföra funktioner som rör avkänning, metabolisk förändring och cellulär databehandling. Här visar vi en snabb och kostnadseffektiv metod för att karakterisera genetiska delar. Vår metod använder cellfritt lysat, framställt internt som medium för att utvärdera delar via uttrycket av ett reporterprotein. Mall-DNA framställs genom PCR-amplifiering med billiga primers för att lägga till variantdelar till rapportgenen, och mallen läggs till reaktionen som linjärt DNA utan kloning. Delar som kan läggas till på detta sätt inkluderar promotorer, operatörer, ribosombindningsställen, isolatorer och terminatorer. Detta tillvägagångssätt, i kombination med införlivandet av en akustisk vätskehanterare och 384-brunnsplattor, gör det möjligt för användaren att utföra utvärderingar med hög genomströmning av genetiska delar på en enda dag. Som jämförelse kräver cellbaserade screeningmetoder tidskrävande kloning och har längre testtider på grund av normaliseringssteg över natten för kultur och kulturtäthet. Vidare tillåter arbetet i cellfritt lysat användaren att exakt skärpa kontrollen över uttrycksförhållandena genom tillsats av exogena komponenter och DNA vid exakta koncentrationer. Resultat från cellfri screening kan användas direkt i tillämpningar av cellfria system eller i vissa fall som ett sätt att förutsäga funktion i hela celler.
En kärninsats inom syntetisk biologi är att utveckla genetiska verktygssatser som innehåller välkarakteriserade delar, som kan användas för att konstruera genetiska kretsar1 som utför användbara funktioner när de används i mikrober eller cellfria lysater. Områden där sådana genetiska kretsar har fått dragkraft är avkänning 2,3,4, mänsklig prestanda5,6, biobränslen7,8, materialproduktion 9,10 och cellulär databehandling 11. Register över standardiserade genetiska delar har upprättats12 för att katalogisera nya och befintliga delar i kategorier som promotorer, operatörer, kodande sekvenser och terminatorer, för att bara nämna några. Insatser som iGEM (international Genetically Engineered Machines) tävling13 har varit avgörande för att karakterisera och katalogisera dessa genetiska delar. Många metoder har utvecklats för att underlätta snabb montering av dessa delar i användbara genetiska kretsar14,15. Programvara har till och med utvecklats för att automatisera sammansättningen av välkarakteriserade delar i kretsar som uppnår en önskad funktion16. Sammansättningen av användbara genetiska kretsar med förutsägbara funktioner vilar dock på antagandet att de genetiska verktygssatserna innehåller välkarakteriserade genetiska delar. På grund av nödvändigheten av dessa verktygssatser mot utvecklingen av syntetisk biologi har många ansträngningar för att bättre katalogisera kretsar och delar med lämpliga karakteriseringsdata beskrivits 17,18,19,20,21.
Ett tillvägagångssätt för att karakterisera genetiska komponenter är att använda cellfria proteinsyntessystem (CFPS), som rekonstruerar cellulära funktioner såsom transkription och translation ex vivo22. Flera studier har visat CFPS: s potential för prototyper av genetiska komponenter 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 antingen för direkta tillämpningar i cellfria system eller för att förutsäga funktionen hos genetiska konstruktioner i celler, såsom den relativa aktiviteten hos delar inom ett bibliotek 29 , metabolisk vägoptimering27 och cellulär börda30. Fördelar med prototyper i CFPS jämfört med celler som lyfts fram i dessa studier inkluderar att undvika tidskrävande kloning, exakt kontroll över koncentrationen av DNA och andra reaktionskomponenter och förmågan att enkelt blanda och matcha flera DNA-konstruktioner. Fördelen med att undvika kloning är särskilt tydlig när man använder linjära DNA-mallar, vilket gör att nya konstruktioner kan monteras med in vitro-metoder som tar timmar istället för dag33. Möjligheten att manipulera koncentrationen av DNA-konstruktioner och andra komponenter helt enkelt genom pipettering gör tillvägagångssättet ännu mer attraktivt genom att möjliggöra experiment med hög genomströmning som drivs av vätskehanteringsrobotar34,35. Även om framgångar med CFPS för prototyper har rapporterats är det viktigt att notera att det återstår att se i vilka sammanhang CFPS-resultat på ett tillförlitligt sätt kan förutsäga funktionalitet i celler.
Här presenterar vi en metod för CFPS-prototyper som betonar fördelarna i hastighet, genomströmning och kostnad jämfört med traditionella cellbaserade metoder. Tillvägagångssättet härrör från vårt tidigare arbete där vi använde CFPS för att snabbt karakterisera ett bibliotek av T7-promotorvarianter som regleras av transkriptionsfaktorn TetR32, vilket avsevärt expanderar på den lilla handfull reglerade T7-promotorvarianter som fanns tillgängliga i litteraturen vid den tiden36,37. Andra har sedan dess ytterligare utökat utbudet av sådana initiativtagare38. I vår metod accelereras genetisk konstruktmontering genom att använda PCR för att förstärka mall-DNA via primers som lägger till olika genetiska delar till en reportergen. Akustisk vätskehantering i plattor med 384 brunnar används för att öka genomströmningen och minska volymen material som krävs. Tidigare arbete har visat framgångsrik användning av akustisk vätskehantering vid betydligt lägre volymer39,40 med variabilitet jämförbar med manuell pipettering av större volymer41. Utöver metoden tillhandahåller vi felsökningsinformation och en bedömning av potentiella kostnads- och tidsbesparingar. Observera att medan vi inkluderar ett protokoll för att producera cellfria lysat baserat på Sun et al.42 här, bör många andra kommersiella kit och protokoll43,44 också fungera. På samma sätt, medan vi demonstrerar metoden för karakterisering av promotorvarianter32, kan andra delar bytas ut genom PCR-amplifiering, såsom riboregulatorer, ribosombindningsställen (RBS), isolatorer, proteintaggar och terminatorer. Vi hoppas att denna metodik kan hjälpa den syntetiska biologin att fortsätta öka antalet karaktäriserade delar för montering av förutsägbara genetiska kretsar med användbar funktion.
De protokoll som beskrivs här ger ett kostnadseffektivt och snabbt sätt att screena genetiska delar via uttrycket av ett rapportprotein av CFPS. Välkarakteriserade genetiska delar är avgörande för utformningen av förutsägbara genetiska kretsar med användbar funktion. Denna metod ökar genomströmningen och minskar den tid som behövs för att screena nya genetiska delar genom att ta bort kravet på att arbeta i levande celler, samtidigt som funktionaliteten som speglar den cellulära miljön bibehålls genom att behålla den metaboliska processen för proteinuttryck i celllysatet. Vårt protokoll kan utföras inom 1 dag efter mottagandet av primers (~ 2,5-6 timmar för reaktionsberedning, 2-16 timmar för CFPS-reaktion; Figur 1), jämfört med minst 3 dagar för traditionell kloning (1 dag vardera för konstruktion, sammansättning och omvandling, sekvensverifiering av kloner och odling av celler för bedömning). Vi uppskattar vidare att kostnaden per konstruktion med linjärt DNA är ungefär en tredjedel av den traditionella kloningen ($ 78 vs. $ 237; Kompletterande tabell 1) metoder. Kommersiella syntestjänster citerar för närvarande minst 4 arbetsdagar beroende på storlek, även om de skulle ha liknande kostnader som vår metod om linjära fragment screenas direkt i CFPS ($ 78 vs. $ 91); Vi har inte verifierat detta tillvägagångssätt. Kostnaden för att utvärdera en del med CFPS är liten jämfört med genereringen av mall-DNA ($ 0.05 / reaktion22 vs. $ 78 per mall), men det bör noteras att startkostnaderna för bulkreagens och lysutrustning är minst flera tusen dollar. Användningen av en akustisk vätskehanterare förbättrar endast marginellt kostnaderna genom att möjliggöra mindre volymer ner till 0,5 μL40; Den mer betydande fördelen är minskningen av tiden för att förbereda reaktioner (~ 10 min vs. upp till 1 h, beroende på antalet reaktioner), särskilt när man förbereder ett stort antal reaktioner väcker oro för förberedd reaktion sittande under längre tider före inkubation.
Även om det är snabbt och kostnadseffektivt återstår det att se begränsningarna för när CFPS-prototyper på ett adekvat sätt förutsäger in vivo-funktionen . Till exempel kommer ingen korsreaktivitet med genomiskt DNA att detekteras på grund av avlägsnande av värdgenomet under produktionen av CFPS-systemet. Dessutom kan komponentkoncentrationerna vara 1-2 storleksordningar lägre i CFPS än i celler51, vilket sannolikt kommer att påverka beteendet hos vissa delar som ett resultat av olika makromolekylära trängselförhållanden. Vidare kan förmågan hos linjärt DNA att förutsäga in vivo-funktion vara begränsad, till exempel när DNA: s sekundära struktur spelar en viktig roll. En sista begränsning är att konstruktioner inte sekvensverifieras innan de testas för funktioner. Det kan finnas fall där den karakteriserade delen faktiskt inte är anpassad till den avsedda teoretiska sekvensen. Alla dessa begränsningar kan mildras genom att validera en delmängd av de delar som screenas med denna metod i den avsedda in vivo-applikationen .
Vi utvecklade ursprungligen denna metod för att undersöka effekterna av att ändra operatörspositionen på hybrid T7-tetO-promotorer 32. Vi har presenterat protokollen här i ett mer generiskt format, så att de kan tillämpas på promotorer, operatörer, ribosombindningssekvenser, isolatorer och terminatorer. Dessa genetiska delar kan läggas till 5ʹ eller 3ʹ änden av reportergenen genom PCR med hjälp av primers för varje design, vilket eliminerar behovet av syntes eller kloning av varje variant för att testa. De resulterande PCR-produkterna fungerar som mall-DNA för utvärdering via uttryck av ett rapportprotein. I vårt arbete användes affinitetsreningsprotokollet som tillhandahålls här för TetR och GamS. Samma procedur kan användas för uttryck och rening av andra repressorer, aktivatorer, polymeraser, sigmafaktorer och andra proteiner som är besläktade med en genetisk del av intresse, även om modifieringar kan behövas för det önskade proteinet som uttrycks. Rening och titrering av dessa proteiner till CFPS-reaktioner möjliggör en mer detaljerad karakterisering av en viss genetisk del. Slutligen finns det många alternativa CFPS-protokoll och vart och ett av dem bör kunna omfattas av metoddelen av analysen. Som ett exempel inkluderar vi inte ett dialyssteg i detta protokoll, vilket andra har funnit vara viktigt för uttryck från inhemska bakteriella promotorer22. Det är också möjligt att variera koncentrationerna av underliggande beståndsdelar i den gemensamma fiskeripolitiken. Användningen av vätskehantering förbättrar förmågan att testa de otaliga förhållandena genom att öka genomströmningen och minska de material som krävs34,35.
Ett område som kan kräva betydande felsökning är optimering av den akustiska vätskehanteraren. Dosering av akustisk vätskehanterare bör optimeras för varje komponent som överförs och det rekommenderas starkt att köra kontroller för att verifiera korrekt distribution och reproducerbarhet innan data samlas in. Den ideala källplattans typ och vätskeklassinställningen beror på den specifika vätskan som ska dispenseras och dess komponenter. Det rekommenderas inte att använda aminbelagda plattor för att dosera DNA, eftersom aminbeläggningen kan interagera med DNA. Det bör också noteras att förmågan att dispensera högre koncentrationer av vissa komponenter kan bero på den akustiska vätskehanterarmodellen. En provvätskeöverföring kan utföras genom dispensering på en folieplatttätning för att visualisera framgångsrik droppbildning. Detta test ger dock begränsad information och droppar från olika inställningar kan se identiska ut. Användningen av ett vattenlösligt färgämne, såsom tartrazin, kan användas för att mer exakt verifiera att rätt volym utelämnas med en given inställning eller arbetsflöde (se Representativa resultat). Optimal programmering av vätskeöverföringar kan också påverka noggrannheten och konsekvensen hos genererade data; För överföringar >1 μL från en källbrunn till en destinationsbrunn har vi funnit att sekventiella överföringar av ≤1 μL bör programmeras för att minska systematisk väl-till-brunn-variabilitet (figur 4). Slutligen kan teoretiska och faktiska källbrunnsdödvolymer variera dramatiskt beroende på källplattans typ, vätskeklassinställning och komponenter i den specifika vätskan; Att använda undersökningsfunktionen för akustisk vätskehanterare för att bedöma brunnsvolymerna innan du kör ett program kan hjälpa till att mäta hur exakt instrumentet kan mäta en viss vätska.
CFPS-reaktionsprestanda kan variera när man jämför resultat mellan olika användare, materialsatser, plattläsare och laboratorier41. För fall där sådana jämförelser krävs vid prototyper av genetiska kretsar rekommenderar vi att du inkluderar interna kontrollreaktioner med standardkonstitutiva promotorer i varje reaktionsplatta för att normalisera resultaten över experimentella inställningar. Metoden för DNA-framställning kan också i hög grad bidra till CFPS-aktiviteten. Införandet av ett utfällningssteg för etanol rekommenderas. Dessutom kan den optimala reaktionskompositionen variera med satsen extrakt34. I synnerhet optimala magnesiumglutamat- och kaliumglutamatkoncentrationer har visat sig variera beroende på sats42 eller med promotor- eller rapportproteinet som används24. Koncentrationerna av dessa komponenter bör optimeras genom screening över flera koncentrationer av varje komponent per genetisk konstruktion och per cellextraktberedning för att bestämma de optimala förhållandena för proteinuttryck. Slutligen omfattar bästa praxis för konsekvent CFPS-reaktionsprestanda noggrann blandning, noggrann pipettering och konsistens vid beredningen av varje reagenskomponent.
Utöver karakterisering av enskilda delar kan samma metod användas för att screena kombinationer av delar som bildar komplexa kretsar, såsom logiska kretsar16 eller oscillatorer52,53. Denna metod kan också tillämpas på screening och optimering av biosensorer för tillämpningar inom epidemiologisk diagnostik 54,55,56,57 eller farodetektering och kvantifiering 3,58,59. Tillämpningen av AI-drivna tekniker som aktivt lärande34 kan också kombineras med metodens höga genomströmningskaraktär för att driva snabb utforskning av komplexa biologiska designutrymmen. I slutändan föreställer vi oss detta tillvägagångssätt som stöder snabbare utvecklingstider för nya genetiska mönster inom syntetisk biologi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete möjliggjordes av försvarsministerns kontor för tillämpad forskning för främjande av vetenskap och teknikprioriteringar. Vi tackar Scott Walper (Naval Research Laboratory) för att tillhandahålla lagret av sfGFP som används, och Zachary Sun och Abel Chiao (Tierra Biosciences) för fruktbara diskussioner relaterade till prototyper med cellfria system och relaterad felsökning av akustisk vätskehantering.
2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y2377-250G | Alternative to making 2xYT media |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | S30 Buffer B |
Agar | Bacto | 214010 | For plating cells |
Chromatography column (5 cm diameter) | BIO-RAD | 731-1550 | Used for protein purification. |
Destination plate | Thermo Scientific Nunc plate | 142761 | For CFPS reactions |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | For dialysis buffer |
DpnI | NEB | R0176L | For digestion of plasmid templates |
DTT | Roche | 20871723 | S30 Buffer B |
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 | Novagen | 70954 | Cell line used for production of lysate and purified proteins |
Echo acoustic liquid handler | Labcyte | 525 | Acoustic liquid handler |
French pressure cell | Thermo Spectronic | FA-078 | For lysing cells for CFPS |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | For buffers |
Impermeable plastic sealable lid | Thermo | 232702 | Plate seal |
IPTG | RPI | I56000-25.0 | Used for protein induction. |
K-Glu | Sigma-Aldrich | g1501-500G | S30 Buffer B |
Labcyte Echo source plate | Labcyte | PL-05525 | For use with Echo acoustic liquid handler |
Mg-Glu | Sigma-Aldrich | 49605-250G | S30 Buffer B |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-250G | For buffers |
NaHPO4 | Sigma-Aldrich | 71505 | For dialysis buffer |
NaOH | Mallinckrodt Chemicals | 7708-10 | For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899 |
Ni-NTA resin | Invitrogen | R901-15 | For production of purified proteins |
PCR H2O | Ambion | AM9937 | PCR of linear templates |
Plate Reader | BioTek | H10 | Plate reader used |
Q5 PCR Master Mix | NEB | M0494S | PCR of linear templates |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28606 | PCR of linear templates |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR of linear templates |
QSonica Ultrasonic Processor | Qsonica | Q700 | Cell disruption during protein purification |
RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | Updated supplier from Sun et al. |
Tris | MP | 819623 | S30 Buffer B |
Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | For buffers |
Tryptone | Fluka | T7293 | For making 2xYT media |
Yeast Extract | Bacto | 212750 | For making 2xYT media |