哺乳類細胞抽出物からのイノシトールピロリン酸の絶対定量のためのキャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析の手順が記載されている。
イノシトールピロリン酸 (PP-InsPs) 細胞内シグナル伝達分子の重要なグループです.イノシトールホスフェート(InsPs)に由来し、これらの分子は、 ミオイノシトール環上に少なくとも1つのエネルギーピロリン酸部分が存在することを特徴とします。それらは真核生物に遍在し、リン酸恒常性、インスリン感受性、および細胞エネルギー電荷を研究する代謝メッセンジャーとして機能します。これらの代謝物に発色団がなく、電荷密度が非常に高く、存在量が少ないため、それらの分析には放射性トレーサーが必要であり、したがって複雑で高価です。ここでは、この研究では、キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析(CE-ESI-MS)による哺乳類細胞からのイノシトールピロリン酸の絶対的かつ高スループット定量を実行するための詳細なプロトコルを示します。この方法は、哺乳類細胞におけるすべての生物学的に関連するPP-InsPs種の高感度プロファイリングを可能にし、位置異性体のベースライン分離を可能にします。マイナー異性体を含むPP-InsPの絶対細胞濃度、およびいくつかの実験条件下でのHCT116細胞におけるそれらの時間的変化のモニタリングが提示されています。
1993年にミオイノシトールピロリン酸(PP-InsPs)が最初に発見されて以来1,2、その生合成、代謝回転、機能の解明は大きく進歩しました3。イノシトールピロリン酸は真核細胞4に遍在的に存在し、例えば、リン酸恒常性5,6、インスリン感受性7、カルシウム振動8,9、小胞輸送10、アポトーシス11、DNA修復12、免疫シグナル伝達13に決定的に関与する代謝シグナル伝達分子として機能します。、その他。イノシトールピロリン酸の制御下にある重要なプロセスの過多は、それらの細胞の存在量のより深い理解を必要とします, 変動, と局在.
InsPとPP-InsPは分野を超えて注目を集めましたが、それらの存在量の分析は、トリチウム化イノシトールで細胞を標識し、抽出したPP-InsPを強陰イオン交換クロマトグラフィーSax-HPLCで分離し、その後シンチレーションカウントするという80年代に開発された方法を使用して日常的に行われています。質量分析に基づく新しい方法は依然として大きな課題に直面しています:最大8つのリン酸単位を有するイノシトールピロリン酸はリン酸エステルおよび無水物を保持しており、イオン化中に重大な負電荷と潜在的なリン酸塩損失をもたらします。哺乳類に見られるPP-InsPには、1,5-(PP)2-InsP 4(または1,5-InsP8)、5-PP-InsP 5(または5-InsP 7)、1-PP-InsP 5(または1-InsP7)、および5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4(または5-PP-InsP 4)3,14の4つの主要なタイプがあります。PP-InsPの生理学的レベルは、典型的にはナノモルから低マイクロモルの範囲であり、5-PP-InsP 5が最も豊富で、細胞濃度は0.5〜5μMである。 1,5-(PP)2-InsP 4および1-PP-InsP5は、5-PP-InsP5プールの最大約10%であると考えられており、多くの細胞で追跡することは依然として困難である15。遊離OH基を有する5-PP-InsP4は存在量がさらに低く、通常はリン酸加水分解酵素がフッ化ナトリウム(NaF)で阻害された場合にのみ検出可能になります16。
PP-InsPの電荷密度が高いと分離が困難になり、PP-InsP位置異性体の発生によりこれらの作業がさらに複雑になります。その結果、ほとんどの実験は、マトリックスからのバックグラウンドが除外され、高感度が達成されるため、[3H]-イノシトールを使用した細胞の代謝放射性標識による定量に依存していました17,18。しかしながら、この方法は費用と時間がかかり、関連するPP−InsP位置異性体を適切に区別することを可能にしない。さらに、[3H]-イノシトール標識は、グルコースからの内因性イノシトール合成を考慮していません。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ベースの方法は、広く適用されている安価な代替品ですが、感度には限界があります19,20,21,22。イオンクロマトグラフィーとそれに続くポストカラム誘導体化UV検出23、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)24、または弱陰イオン交換(WAX)と質量分析(MS)25の組み合わせなど、放射性標識を回避する他のアプローチが発表されています。ただし、それらは(まだ)従来の[3H]-イノシトールSAX-HPLCプロトコルと同等ではありません。
最近、キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析(CE-ESI-MS)が、InsPおよびPP-InsPs代謝の分析のための変革戦略として導入され、上記のすべての要件を満たしました16。CE-ESI-MSは、過塩素酸による現在の最先端のInsP抽出とそれに続く二酸化チタンビーズ26による濃縮と組み合わせることで、酵母から植物や哺乳類まで、これまでにテストされたすべての生物で成功しました。すべての可能な位置異性体を含むInsPとPP-InsPの同時プロファイリングは容易に達成されました。安定同位体標識(SIL)内部標準により、マトリックス効果に関係なく、迅速かつ正確な絶対定量が可能になりました。MSは同位体質量の違いを捉えることができるため、CE-ESI-MSは、細胞に[13C6]-ミオイノシトールまたは[13C6]-D-グルコースを供給するなど、InsPおよびPP-InsPの区画化された細胞合成経路の研究にも適用できます。
CE-ESI-MSによる哺乳類細胞からのPP-InsPおよびInsPの絶対定量のための詳細なステップバイステップのプロトコルをここで説明します。主要な5-PP-InsP 5異性体とは別に、1,5-(PP)2-InsP 4および1-PP-InsP5も、存在量が少ないにもかかわらず、この研究では定量化されています。異なる研究所(NIH、UCL)からの2つのHCT116細胞株が研究されており、HCT116UCL細胞にはHCT116NIHに見られるよりも7倍高いレベルの1,5-(PP)2-InsP 4が含まれていることが検証されていますが、5-PP-InsP5濃度は同等です。加えて、HCT116UCLにおける1-PP-InsP5合成は有意に増加していない。また、フッ化ナトリウムを用いてPP-InsPの脱リン酸化を阻止することによるPP-InsPレベルの増加を定量的に研究しています。
ここで紹介するのは、哺乳類細胞中の高荷電イノシトールピロリン酸を定量するための実用的で高感度な方法です。この分析アプローチと、過塩素酸による現在の最先端のInsP抽出とそれに続くTiO2による濃縮を組み合わせることで、CE-ESI-MS分析には前例のない利点があります。スループット、感度、安定性、絶対定量、異性体同定、およびマトリックス依存性に関して、この方法は他のアプローチと比較して際立っています。このプロトコルは哺乳類細胞に適用できますが、実際、この戦略は多くの異なるサンプル(酵母、植物、寄生虫、マウス組織など)で成功しています。
適用された抽出プロトコルは、哺乳類細胞抽出物からPP-InsPおよびInsP6を完全に回収する16,19。また、他の多くの陰イオン代謝物、特にリン酸含有種、例えば糖リン酸およびヌクレオチドを抽出する。このプロトコルを使用したユーザーの分析種の回収と分解の評価が必要になります。
一般に、CE-ESI-MSシステムはスムーズに動作し、このプロトコルを使用して毎週約200サンプルに対応できます。しかし、HPLCとは異なり、CEは長い間専門家や専門家のための方法と見なされており、市場を制限し、アプリケーションを制限してきました。したがって、CE-ESI-MSデバイスは通常、分析学部には存在しません。CE-ESI-MS分析を実行したい人は、おそらくCEの経験が不足しており、トラブルシューティングにより多くの時間を費やすでしょう。ここでは、重要なステップが強調表示されています。何よりもまず、キャピラリーカットの品質です。ESIスプレーの感度と安定性は、主に一流のキャピラリーカットに依存しています。第二に、毛細管出口端は噴霧器先端から正確に0.1 mm離れている必要があります。噴霧器の針とCE毛細管は軸方向にある必要があります。ESIスプレーの品質は定量にとって重要です。再現性を評価するために技術的な実行を実行する必要があります。
記載されたプロトコルでは、PP-InsPの定量限界(LOQ)は、50mbarで10秒間(10nL)注入した場合で40nMです。メソッド感度をさらに高めるには、いくつかのアプローチがあります。まず、100 mbarで20秒(40 nL)の注入でも、位置異性体5-PP-InsP 5および1-PP-InsP5に対して良好なピーク形状と十分な分解能が得られます。第二に、InsP抽出物は少量の水に溶解することができる。第三に、定量に使用するMRM遷移が少ない場合、滞留時間が長くなる可能性があります。さらに、超低シース液流を使用するCE-MSイオン源は、感度を大幅に向上させます。
pH 9のCEランニングバッファーは、InsP6-InsP 8の間で最高の分解能を提供します。pHを9.7に上げると、InsP3-InsP 6 間の分解能が大幅に向上します。優れた分解能のため、スループットをさらに向上させるために、キャピラリー長を72cm短くすることをお勧めします。さらに、40°CでCEカセット温度が高くなると、水性電気泳動バッファーの粘度が低下し、EOF下での移動が加速します。さまざまな研究要求に応じて、この方法を変更すると、InsPおよびPP-InsPの分析がさらに容易になります。したがって、記載されたCE-ESI-MSプロトコルは、この多面的なシグナル伝達分子ファミリーへの新しい研究の道を開く可能性を秘めています。
The authors have nothing to disclose.
このプロジェクトは、欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラム(HJJへの助成金契約番号864246)の下で欧州研究会議(ERC)から資金提供を受けています。DQは、ブリジッテ・シュリーベン・ランゲ・プログラムからの財政的支援を認めています。AS は、MRC プログラム助成金 MR/T028904/1 によってサポートされています。
Materials | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | – |
15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | – |
2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | – |
50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | – |
96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
T75 flasks | TPP | 90076 | – |
Chemicals and Reagents | |||
NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | – |
Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
PBS | Gibco | 10010015 | – |
Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | – |
TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
Equipment | |||
Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
CE system | Agilent | G7100A | – |
CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | – |
CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | – |
Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
ESI source | Agilent | AJS ESI | – |
Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
Ice box | – | – | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | – |
Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
Software | |||
MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | – |
QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | – |