Получение многофункциональных микрокапсул на основе шелка, загруженных ДНК-плазмидами, кодирующими РНК-аптамеры и рибопереключатели
Summary
Протокол описывает формирование надежных и биосовместимых микрокапсул, нагруженных ДНК, в виде мультиплексированных биосенсоров in vitro , способных отслеживать несколько лигандов.
Abstract
Мы представляем протокол для получения микрокапсул волокоина шелка, нагруженных ДНК, с помощью метода послойной сборки (LbL) на жертвенных сферических ядрах. После адсорбции первичного слоя и плазмид ДНК образованию прочных микрокапсул способствовала индуцирование β-листов во вторичной структуре шелка при остром обезвоживании одного слоя шелка. Следовательно, наслоение происходило за счет множественных водородных связей и гидрофобных взаимодействий. После адсорбции многослойных оболочек структуры ядро-оболочка могут быть дополнительно функционализированы наночастицами золота (AuNP) и/или антителами (IgG) для использования для дистанционного зондирования и/или адресной доставки. Корректировка нескольких ключевых параметров во время последовательного осаждения ключевых макромолекул на ядрах кремнезема, таких как присутствие полимерного праймера, концентрация ДНК и белка шелка, а также ряд адсорбированных слоев, привела к созданию биосовместимых, нагруженных ДНК микрокапсул с переменной проницаемостью и нагрузкой ДНК. При растворении ядер кремнезема протокол продемонстрировал образование полых и прочных микрокапсул с плазмидами ДНК, иммобилизованными на внутреннюю поверхность мембраны капсулы. Создание селективно проницаемой биосовместимой мембраны между плазмидами ДНК и внешней средой сохранило ДНК при длительном хранении и сыграло важную роль в улучшении выходного ответа от пространственно ограниченных плазмид. Активность матриц ДНК и их доступность проверяли в ходе реакций транскрипции и трансляции in vitro (бесклеточные системы). ДНК-плазмиды, кодирующие светящиеся аптамеры РНК и рибопереключатели, были успешно активированы соответствующими аналитами, что было визуализировано при локализации флуоресцентно меченных транскриптов РНК или белка GFPa1 в мембранах оболочки.
Introduction
Область синтетической биологии предлагает уникальные возможности для развития сенсорных возможностей путем использования естественных механизмов, эволюционирующих микроорганизмами, для мониторинга окружающей среды и потенциальных угроз. Важно отметить, что эти сенсорные механизмы, как правило, связаны с реакцией, которая защищает эти микроорганизмы от вредного воздействия, регулируя экспрессию генов для смягчения негативных эффектов или предотвращения поступления токсичных материалов. Были предприняты значительные усилия по созданию этих микроорганизмов для создания цельноклеточных сенсоров, использующих преимущества этих естественных реакций, но перенаправляющих их на распознавание новых мишеней и/или на получение измеримого сигнала, который можно измерить для целей количественного определения (обычно флуоресценции)1,2. В настоящее время опасения по поводу использования генетически модифицированных микроорганизмов (ГМО), особенно при высвобождении в окружающую среду или организм человека, из-за утечки целых клеток или части их генетического материала, даже если они инкапсулированы в полимерную матрицу, предполагают, что необходимы альтернативные способы использования этих сенсорных подходов3.
Мощным подходом к использованию преимуществ зондирования на основе микроорганизмов без заботы о внедрении ГМО является использование систем транскрипции/трансляции in vitro (IVTT). С практической точки зрения, системы IVTT состоят из смеси, содержащей большинство клеточных компонентов в активном состоянии, которая была «извлечена» из клеток различными способами, включая обработку ультразвуком, биение шариков или другие4. Конечным продуктом этого процесса является биохимическая реакционная смесь, уже оптимизированная для выполнения транскрипции и трансляции, которая может быть использована для тестирования различных датчиков в формате «открытого сосуда» без ограничений, связанных с использованием целых клеток (мембранная диффузия, эффективность трансформации, клеточная токсичность и т. д.). Важно отметить, что различные компоненты датчика могут быть количественно добавлены, и их влияние изучается различными оптическими и спектрометрическими методами, как мы продемонстрировали5. Было замечено, что производительность систем IVTT может быть непостоянной; Тем не менее, недавние исследования показали подходы к стандартизации их подготовки и определения характеристик, что очень помогает при изучении их характеристик в конструкциидатчика 6. В последнее время было продемонстрировано множество примеров использования систем IVTT для создания бумажных анализов путем лиофилизации их компонентов в бумажных матрицах, включая обнаружение ионов тяжелых металлов, лекарств, чувствительных элементов кворума и др. 7,8,9. Интересным пространством применения датчиков на основе IVTT является их использование в сенсорных приложениях в различных типах сред, включая почву, воду и человеческое тело. Чтобы развернуть эти системы IVTT в этих сложных средах, необходимо реализовать подход к инкапсуляции, чтобы содержать компоненты IVTT и защищать их от деградации.
Наиболее распространенные подходы к инкапсуляции для систем IVTT включают использование липидных капсул, мицелл, полимерсом и других плотно закрытых микроконтейнеров10,11,12. Одним из недостатков этого подхода является необходимость включения либо пассивных, либо активных механизмов для транспортировки материалов в контейнеры и из них, чтобы обеспечить связь с внешней средой и обеспечить возможности зондирования. Чтобы преодолеть некоторые из этих проблем, в исследовании сообщается о методе, который обеспечивает простой, но эффективный подход к инкапсуляции кодирующих материалов для различных конструкций датчиков, которые будут выражаться в системах IVTT. Этот подход основан на использовании послойного (LbL) осаждения биополимера в присутствии интересующих плазмид для создания полых микрокапсул с высокой пористостью, что позволяет защищенному генетическому материалу взаимодействовать с различными компонентами IVTT по выбору. Исследование показало, что инкапсулированные плазмиды могут направлять транскрипцию и трансляцию при активации в этой полимерной матрице, как показано в ответе кодируемого плазмидой аптамера и рибопереключателя на соответствующие мишени. Кроме того, это покрытие LbL защищает плазмиды в течение нескольких месяцев без каких-либо специальных условий хранения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Селективно проницаемые гидрогелевые микрокапсулы, загруженные различными типами ДНК-кодируемых сенсорных конструкций, могут быть получены в соответствии с этим протоколом. Одной из отличительных особенностей подхода LbL является возможность адаптировать сложность микрокапсул во вр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом LRIR 16RH3003J от Управления научных исследований ВВС, а также программой «Синтетическая биология для военной среды: прикладные исследования для продвижения приоритетов науки и техники» (ARAP) Управления заместителя министра обороны США по исследованиям и разработкам.
Последовательность плазмидных векторов для ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 кб) была щедро предоставлена доктором J. Gallivan. Коконы тутового шелкопряда из Bombyx mori были щедро пожертвованы доктором Д.Л. Капланом из Университета Тафтса, штат Массачусетс.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
