Fra celler til cellefri proteinsyntese inden for 24 timer ved hjælp af cellefri autoinduktionsarbejdsgang
Summary
Dette arbejde beskriver fremstillingen af celleekstrakt fra Escherichia coli (E. coli) efterfulgt af cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner på under 24 timer. Forklaring af den cellefri autoinduktion (CFAI) protokol beskriver forbedringer foretaget for at reducere forskertilsyn og øge mængderne af opnået celleekstrakt.
Abstract
Cellefri proteinsyntese (CFPS) er vokset som en bioteknologisk platform, der fanger transkriptions- og oversættelsesmaskiner in vitro. Talrige udviklinger har gjort CFPS-platformen mere tilgængelig for nye brugere og har udvidet anvendelsesområdet. For lysatbaserede CFPS-systemer kan celleekstrakter genereres fra en række organismer, der udnytter den unikke biokemi hos denne vært til at øge proteinsyntesen. Inden for de sidste 20 år er Escherichia coli (E. coli) blevet en af de mest anvendte organismer til støtte for CFPS på grund af dens overkommelige priser og alsidighed. På trods af mange vigtige fremskridt er arbejdsgangen for E. coli-celleekstraktforberedelse forblevet en vigtig flaskehals for nye brugere til at implementere CFPS til deres applikationer. Arbejdsgangen til forberedelse af ekstrakter er tidskrævende og kræver teknisk ekspertise for at opnå reproducerbare resultater. For at overvinde disse barrierer har vi tidligere rapporteret om udviklingen af en 24-timers cellefri autoinduktionsarbejdsgang (CFAI), der reducerer brugerinput og den nødvendige tekniske ekspertise. CFAI-arbejdsgangen minimerer den arbejdskraft og tekniske færdighed, der kræves for at generere celleekstrakter, samtidig med at de samlede mængder celleekstrakter, der opnås, øges. Her beskriver vi denne arbejdsgang trin for trin for at forbedre adgangen til og understøtte den brede implementering af E. coli-baserede CFPS.
Introduction
Anvendelsen af cellefri proteinsyntese (CFPS) til bioteknologiske anvendelser er vokset betydeligt i løbet af de sidste par år 1,2,3. Denne udvikling kan til dels tilskrives en øget indsats for at forstå de processer, der forekommer i DE FÆLLES FISKERI-systemer, og den rolle, som hver komponent 4,5 spiller. Derudover har reducerede omkostninger, der tilskrives optimerede opsætninger og alternative energikilder, gjort cellefri teknologi lettere at implementere for nye brugere 6,7,8,9. For at implementere de nødvendige transkriptions- og oversættelsesfaktorer til proteinsyntese bruges celleekstrakt ofte til at drive cellefrie reaktioner10. Nyligt offentliggjorte brugervejledninger har givet enkle protokoller til fremstilling af funktionelt uddrag, hvilket gør det lettere at implementere for både nye og erfarne brugere 1,11,12,13,14. Celleekstrakt opnås normalt gennem lysis af en cellekultur, som kan dyrkes ved hjælp af forskellige organismer afhængigt af den ønskede specifikke anvendelse 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) er hurtigt blevet en af de mest almindeligt anvendte værtsorganismer til fremstilling af funktionelle ekstrakter17. BL21 Star (DE3) stammen foretrækkes, fordi den fjerner proteaserne fra den ydre membran (OmpT protease) og cytoplasmaet (Lon protease), hvilket giver et optimalt miljø for det rekombinante proteinekspression. Derudover indeholder DE3 λDE3, der bærer genet for T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) under kontrol af lacUV5-promotoren; stjernekomponenten indeholder et muteret RNaseE-gen, som forhindrer spaltning af mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotoren tillader isopropyl-thiogalactopyranosid (IPTG) induktion ekspression af T7 RNAP20,21. Disse stammer bruges til at dyrke og høste celler, som giver råmateriale til ekstraktforberedelse. Cellelyse kan udføres ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder perleslag, fransk presse, homogenisering, sonikering og nitrogenkavitation 1,11,12,22.
Processen med bakteriekultur og høst er konsistent på tværs af de fleste platforme, når man bruger E. coli, men kræver flere dage og intenst forskertilsyn 1,11,13. Denne proces starter generelt med en frøkultur natten over i LB bouillon, som ved nattens vækst derefter podes i en større kultur på 2xYTPG (gær, tryptone, fosfatbuffer, glucose) den næste dag. Væksten af denne større kultur overvåges, indtil den når den tidlige til midterste logfase ved en optisk densitet (OD) på 2,514,20. Konstant måling er påkrævet, da komponenterne i transkription og oversættelse tidligere har vist sig at være meget aktive i den tidlige til midterste logfase23,24. Selvom denne proces kan skabe reproducerbart ekstrakt, har vores laboratorium for nylig udviklet en ny metode ved hjælp af Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, som reducerer forskertilsyn, øger det samlede udbytte af ekstrakt for en given liter cellekultur og forbedrer adgangen til E. coli-baseret ekstraktpræparat for både erfarne og nye brugere (figur 1 ). Her giver vi den trinvise vejledning til implementering af CFAI-arbejdsgangen for at gå fra en stribet plade af celler til en afsluttet CFPS-reaktion inden for 24 timer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskertilsyn er traditionelt nødvendigt for to nøgleaktioner under cellevækst: induktion af T7 RNAP og høst af celler ved en bestemt OD600. CFAI undgår begge disse krav for at reducere forskerens tid og tekniske uddannelse, der kræves for at forberede celleekstrakter af høj kvalitet. Auto-induktion af T7 RNAP opnås ved at erstatte glucose med lactose som det primære sukker i medierne, hvilket undgår det tidligere behov for aktivt at overvåge væksten og derefter inducere med IPTG på et præcist ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere vil gerne anerkende Dr. Jennifer VanderKelen og Andrea Laubscher for teknisk support. Forfattere vil også gerne takke Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington og Jillian Kasman for nyttige diskussioner. Forfattere anerkender også finansieringsstøtte fra Bill og Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology’s Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly og National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
