マウス脳のフリーフローティング免疫染色
Summary
このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。
Abstract
マウス脳の免疫構造化学的染色は、エネルギー代謝やその他の神経生物学的プロセスの調節の基礎となる中心的なメカニズムを調査するために神経科学で一般的に使用される日常的な技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、実験室によって異なる場合があります。染色実験ごとに、種、組織、標的タンパク質、試薬の作業条件の違いに基づいて重要な手順を最適化する必要があります。本論文では、大動脈灌流、脳切除、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、この分野の研究者が容易に追跡できる信頼性の高いワークフローを詳細に示す。
また、研究者の個々のニーズを満たすためにこれらの手順を変更する方法についても説明します。このプロトコルの信頼性と効率を説明するために、ペリニューロンネットは、マウス脳内の抗AVP抗体を有するビオチン標識藤フラルブダ凝集(WFA)およびアルギニンバソプレシン(AVP)で染色された。最後に、手順全体の重要な詳細が取り上げられており、このプロトコルの利点は他のプロトコルのそれと比較されます。本論文は、マウス脳組織の自由浮遊免疫染色に最適化されたプロトコルを提示する。このプロトコルに従うと、このプロセスは、ジュニアと上級の両方の科学者が免疫染色研究の品質、信頼性、および再現性を向上させることが容易になります。
Introduction
肥満とそれに伴う併存疾患の有病率は流行レベルに達し、社会経済的負担が大きい1,2を引き起こしている。肥満の原因となる生物学的プロセスをより深く理解するために、様々なマウスモデルが開発されました3,4。これらの動物モデルにおけるエネルギー恒常性の調節には中心的なメカニズムが重要であるため、マウス脳の神経解剖学的研究はこの分野で必要な技術となっています。しかし、脳組織学の技術の品質、信頼性、再現性は、様々な理由(例えば、抗体、組織、治療、種、研究目的)のために、同じ研究室内の研究室や研究者によってかなり異なります。したがって、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、マウス脳の組織学的研究のための一般的なプロトコルを確立する必要があります。一方、初心者は、迅速に学び、マスターし、個々のニーズを満たすために、このプロトコルを調整することができます。
免疫組織化学的染色は、様々な組織(例えば、脳および末梢組織)における特定の細胞タイプ、mRNA、およびタンパク質を可視化するために広く使用されてきた確立された方法である5,6。より具体的には、目的の抗原は、酵素(例えば、発色性免疫組織化学)または蛍光色素(フルオレセイン等性菌化)6に結合した特異的一次抗体および対応する二次抗体によって標識することができる。これらの技術の有用性の一例として、β-エンドルフィン(プロアピオメラノコルチン(POMC)でコードされる1つのペプチド)およびc-fos(ニューロン活性のマーカー)を円弧核に染色した。トリプトファンヒドロキシラーゼ2(セロトニン合成に不可欠な酵素)の欠失は、アルクアテ核中のPOMCニューロンにおけるc-fos発現を減少させることが示された。また、ビタミンD受容体mRNAの分布を、その領域ハイブリダイゼーション(RNAscope)8でマウス脳内にマッピングした。本論文は、マウス脳の組織学的研究の質と再現性を向上させることを目的として、自由浮遊免疫染色のためのステップバイステップのワークフローを用いて、信頼性の高い効率的な方法を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、灌流、組織切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳の神経解剖学的研究のための確立された方法を提供する。ただし、一貫性のある信頼性の高い結果を得るには、いくつかの重要な詳細を最適化する必要があります。
灌流の質は、染色を成功させるために重要です。血液細胞(例えば、赤血球)が人工的な「陽性」染色<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
調査官はNIH(K01DK119471からCWへの助成金)によって支えられました。P01DK113954、R01DK115761、R01DK117281、R01DK125480、R01DK120858からYX、USDA/CRIS(51000-064-01SからYX)、および米国心臓協会の博士研究員(LTX)829565
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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