Summary
Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.
Abstract
Son yıllarda, ribozomların sadece mRNA'mızın şifresini çözmekle kalmayıp, aynı zamanda polipeptit zincirinin kalabalık hücresel ortama ortaya çıkmasına rehberlik ettiği de ortaya çıkmıştır. Ribozomlar, membran hedefleme faktörlerinin uzamsal ve kinetik olarak kontrol edilen bağlanması, enzimlerin modifiye edilmesi ve şaperonların katlanması için platform sağlar. Yüksek dereceli oligomerik komplekslere ve protein-protein ağı oluşum adımlarına montajın bile sentezle koordine edildiği yakın zamanda keşfedilmiştir.
Burada, in vivo olarak eş-translasyonel etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiş bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz. Ribozom-nazen-zincir komplekslerini ko-translasyonel interaktörlerle birlikte yakalamak için gereken çeşitli afinite saflaştırma adımlarını ve ayrıca kodona yakın çözünürlükte ko-translasyonel etkileşimleri deşifre etmek için gereken mRNA ekstraksiyonu, boyut dışlama, ters transkripsiyon, derin dizileme ve büyük veri analizi adımlarını detaylandıracağız.
Introduction
Selective Ribozom Profiling (SeRP), bugüne kadar, ko-translasyonel etkileşimleri, in vivo, doğrudan bir şekilde 1,2,3,4,5,6 olarak yakalayan ve karakterize eden tek yöntemdir. SeRP, ribozomların 2,7'ye yakın çözünürlükte çevrilmesiyle herhangi bir faktörün etkileşimlerinin global profillenmesini sağlar.
Yöntem, büyüyen hücrelerin flaş dondurulmasına ve aktif çevirinin korunmasına dayanır. Hücre lizatları daha sonra "ribozom ayak izleri" olarak adlandırılan ribozom korumalı mRNA fragmanları hariç hücredeki tüm mRNA'yı sindirmek için RNaz I ile muamele edilir. Numune daha sonra iki bölüme ayrılır; Bir kısım doğrudan tüm hücresel ribozomal ayak izlerinin izolasyonu için kullanılır ve hücrede devam eden tüm translasyonu temsil eder. İkinci bölüm, bir ilgi faktörü ile ilişkili ribozomların spesifik alt kümesinin afinite saflaştırılması için kullanılır, örneğin: enzimleri değiştirmek, translokasyon faktörleri, şaperonları katlamak ve karmaşık montaj etkileşimleri. Afinite saflaştırılmış ribozomal ayak izleri topluca interaktom olarak adlandırılır. Daha sonra, ribozom korumalı mRNA'lar ekstrakte edilir ve cDNA kütüphanesi üretimi için kullanılır, ardından derin dizileme yapılır.
Toplam translatom ve interaktom örneklerinin karşılaştırmalı analizi, ilgi faktörü ile ilişkili tüm orfların tanımlanmasına ve her bir orf etkileşim profilinin karakterizasyonuna izin verir. Bu profil, kodu çözülmüş kodonları ve ortaya çıkan polipeptit zincirinin ilgili kalıntılarını ve ayrıca etkileşim 7,8 sırasındaki ribozom hız değişimlerini çıkarabileceğiniz kesin katılım başlangıcı ve sonlandırma dizilerini rapor eder. Şekil 1'de protokol şematik olarak gösterilmektedir.
Şekil 1: SeRP protokolüne genel bakış. Bu protokol 7-10 gün içinde bütünüyle gerçekleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Seçici Ribozom Profilleme için suşların oluşturulması
NOT: Selective Ribozom Profiling (SeRP), ribozom-yeni ortaya çıkan zincir kompleksleri ile etkileşim tarzlarını değerlendirmek için ilgi faktörlerinin afinite saflaştırılmasına dayanan bir yöntemdir. Homolog rekombinasyon9 ve CRISPR / Cas910 tabanlı yöntemler, çeşitli ilgi çekici faktörleri afinite saflaştırmaları için etiketlerle birleştirmek için kullanılır. Bu tür etiketler, GFP-tuzak afinite saflaştırmaları için GFP, IgG-Sepharose boncuk saflaştırmaları için TAP etiketi ve avidin veya streptavidin tarafından saflaştırılmış AVI-Tag'dir.
- Etiketlemenin proteinlerin işlevini etkilemediğini doğrulamak için büyüme veya fonksiyonel testler yapın. N' ve C' terminal etiketlemesi değerlendirilmelidir.
NOT: Ribozomlar (rRNA) ve çeşitli faktörlerdeki birçok ribozom bağlayıcı etki alanı yüksek oranda yüklüdür, bu da yanlış keşfe veya değiştirilmiş bağlanma moduna yol açabileceğinden, yüksek yüklü etiketlerin (polihistidin gibi) kullanılmasını tercih edilmez hale getirir.
2. Kültür gelişimi
- İstenilen etiketli proteinleri içeren inşa edilmiş maya kültürlerini (BY4741 suşuna dayanarak), sıvı maya-ekstrakt-pepton-dekstroz (YPD) bakımından zengin ortamda veya sentetik dekstroz (SD) minimal ortamda (amonyum sülfatlı 1.7 g / L maya azot baz veya 1 g / L monosodyum glutamik asit, % 2 glikoz ile amonyum sülfat içermeyen 1.7 g / L maya azot bazı, tam veya uygun bir amino asit karışımı ile desteklenmiş) yetiştirin.
- 250-500 mL hücre kültürünü, uygun bir ortamda,30 ° C'de 0.5 OD 600'e (orta log) büyütün.
3. Hücre toplama ve lizis
- Cam filtreleme sistemli 0,45 μm nitroselüloz lekeleme membranı (1 L cam hunili cam filtre tutucu, vakum tabanı ve kapak, paslanmaz çelik elek, conta ve yay kelepçesi, 90 mm; zemin derzi şişesi 1 L) üzerinde vakum filtrasyonu ile hücreleri hızla toplayın.
- Pelet edilmiş hücreleri bir spatula ile kazıyarak ve hemen sıvı azot dolu 50 mL'lik bir tüpe batırarak toplanan hücreleri dondurun.
DURMA NOKTASI: Hücreler -80 °C'de 3-4 haftaya kadar saklanabilir. - Bir karıştırıcı değirmeninde kriyojenik öğütme ile hücre lizisini gerçekleştirin: lizis tamponunun 1 mL'si ile 30 Hz'de 2 dakika boyunca iki kez (bkz. Tablo 1). Frezelemeler arasında sıvı azotta soğutun.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| 10 mg/mL CHX (sikloheksimid) | 220 | 0.5 mg/mL |
| 1M Tris-HCl pH 8,0 | 88 | 20 mM |
| 3M KCl | 205.7 | 140 mM |
| 1M MgCl2 | 26.4 | 6 mM |
| 1 milyon PMSF | 4.4 | 1 mM |
| NP-40 Serisi | 4.4 | 0.10% |
| Proteaz inhibitörü | 2 tablet | |
| DNase I | 8.8 | 0,02 U/mL |
| Son cilt | 4,400 |
Tablo 1: Lizis tamponu ana karışımı için tarif.
NOT: Lizis tamponu, ilgilenilen proteinin çok kararsız olması durumunda daha fazla proteaz inhibitörü (bestatin, leupeptin, aprotinin vb. gibi) içerecek şekilde değiştirilebilir, ancak ribozomun aşağıdaki adımlar sırasında monte edilen küçük ve büyük alt birimlerini korumak için EDTA'dan kaçınmak önemlidir. Benzer nedenlerden dolayı, tampon çözeltisinde daima en az 6 mM MgCl2 bulundurun.
DİKKAT: HCl oldukça aşındırıcıdır ve PMSF toksiktir. Eldiven giyin ve dikkatli kullanın.
- Lisatı temizlemek ve süpernatan toplamak için 30.000 x g, 4 °C'de 2 dakika santrifüj yapın.
4. SeRP için ribozom-nazen-zincir komplekslerinin saflaştırılması
- Her deney için, süpernatantı iki bölüme ayırın; her biri farklı bir mikrosantrifüj tüpünde: toplam RNA örneği (~200 μL) ve immünopurifikasyon (IP) numunesi (~700 μL) translatom örnekleri.
-
Toplam RNA örneğinin işlenmesi
- Toplam RNA örneğini 4 ° C'de 25 dakika boyunca 10 U RNaz I kullanarak sindirin; dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de döndürün.
NOT: Sindirim koşulları, monozomların aşırı veya az sindiriminin pik olmadığından emin olmak için polizom profilleme kullanılarak kalibre edilebilir. - Sakkaroz yastığı ana karışımını Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- Toplam RNA örneğini 4 ° C'de 25 dakika boyunca 10 U RNaz I kullanarak sindirin; dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de döndürün.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| %50 Sakkaroz | 200 | 25% |
| 1M Tris-HCl pH 8,0 | 8 | 20 mM |
| 3M KCl | 18.7 | 140 mM |
| 1M MgCl2 | 4 | 10 mM |
| 100 mg/mL CHX | 0.4 | 0.1 mg/mL |
| Proteaz inhibitörü | 1 tablet | |
| Son cilt | 400 |
Tablo 2: Sakkaroz yastığı ana karışımı tarifi.
- Numuneyi 400 μL sakkaroz yastığına yükleyin ve TLA120 rotorlu santrifüjü 245.000 x g ve 4 °C'de 90 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı bir vakum pompası ile hızlı bir şekilde çıkarın ve 150 μL lizis tamponu ile peletleri yerleştirin. Peletleri 4 °C'de ve 300 RPM'de 1 saat sallayarak yeniden askıya alın.
- Artık peleti pipetle bağlayarak ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktararak yeniden askıya alın.
NOT: Toplam translatomun ribozom profilinin çıkarılması için genellikle 100-200 μg toplam RNA yeterlidir. Ribozom-yeni doğan zincir komplekslerinin en yaygın kirleticisi olan rRNA kontaminasyonunu azaltmak için rRNA tükenme adımı eklenebilir11 (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakınız).
-
İmmünopurifikasyon numunesinin işlenmesi
- Örnek başına 100-400 μL afinite bağlayıcı matrisi (% 70 EtOH'de 1: 1 antikor konjuge boncuklar) 3 x 1 mL lizis tamponu (DNaz I ve proteaz inhibitörleri olmadan) ile yıkayın; Lizis tamponundaki afinite matrisini yeniden askıya alın ve ardından 5 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de döndürün. 3.000 x g, 4 °C'de 30 s santrifüjleme ile çökeltin. Üst sıvıyı atın. Üç kez tekrarlayın.
- İmmünopurifikasyon numunelerini, A260 nm RNaz I birimi başına 10 U, afinite bağlayıcı matris (örneğin, numune başına 100-400 μL GFP-TRAP) ile birlikte sindirin.
- Proteini 4 ° C'de afinite matrisine bağlamak için dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de 25 dakika döndürün.
- Yıkama tamponu ana karışımını Tablo 3'te ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde hazırlayın.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| 10 mg/mL CHX | 50 | 0.1 mg/mL |
| 1M Tris-HCl pH 8,0 | 100 | 20 mM |
| 3M KCl | 233 | 140 mM |
| 1M MgCl2 | 50 | 10 mM |
| 1 milyon PMSF | 5 | 1 mM |
| NP-40 Serisi | 0.5 | 0.01% |
| Proteaz inhibitörü | 2 tablet | |
| %50 Gliserol | 1,000 | 10% |
| Son cilt | 5,000 |
Tablo 3: Yıkama tamponu ana karışımı için tarif.
- Afinite bağlama matrisini, her seferinde ~ 1 dakika boyunca, karışım rafında 30 RPM'de, 4 ° C'de döndürerek, 1 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
- 4 °C'de 30 s için 3.000 x g'de santrifüjleme ile çökeltin. Üst sıvıyı atın.
- 1 mL yıkama tamponunda, her seferinde 5 dakika boyunca, karışım rafında 30 RPM'de, 4 °C'de dönerek iki kez daha yıkayın.
- 3.000 x g ve 4 °C'de 30 s santrifüjleme ile çökeltin.
- Aynı miktarda 2x numune tamponu ile protein elüsyonu için 50 μL boncuk kullanın. RNA ekstraksiyonu için boncukların geri kalanını kullanın.
- Boncukları peletlemek ve üst sıvıyı atmak için 3.000 x g, 4 °C'de 30 s santrifüj.
- Sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu örnekleri sonraki RNA ekstraksiyonu için kullanın.
DURMA NOKTASI: Numuneler gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklanabilir. Bu bir durma noktası olabilir. - Her adımın afinite saflaştırma adımının başarısını batı lekesi veya Coomassie boyaması ile alikotlarla (karıştırmadan sonra hacimce ~% 10) değerlendirin. Benzeşim matrisine spesifik olmayan bağlanma denetimi olarak etiketsiz bir WT suşunda her zaman sahte IP kullanın.
NOT: Yüksek spesifik olmayan arka plan, artan tuz/deterjan konsantrasyonları ile ek yıkama adımlarıyla aşılabilir. Geçici etkileşim, çeşitli çapraz bağlayıcı ajanların tedavisi ile stabilize edilebilir, örneğin, canlı hücrelerin paraformaldehit (PFA) tedavisi - 2-5 dakika boyunca büyüme ortamına% 0.4 -% 1 PFA eklenmesi, ardından 3 dakika boyunca glisin (0.3 M) söndürülmesi şiddetle tavsiye edilir.
DİKKAT: Paraformaldehit şüpheli bir kanserojendir. Paraformaldehit hızla buharlaştığından ve aşındırıcı olduğundan, kimyasal bir güvenlik başlığında çalışın ve iki kat eldiven giyin.
5. Derin dizileme için cDNA kütüphanesi hazırlığı
- RNA ekstraksiyonu
NOT: Olası RNA veya DNA tükenmesini önlemek için RNaz içermeyen yapışmaz 1,5 mL tüplerle çalışın.- 4.2.5 ve 4.3.12 adımlarındaki numuneleri buz üzerinde çözün ve 10 mM Tris-HCl pH 7.0 ile numuneleri 700 μL'lik son hacme kadar askıya alın.
DİKKAT: Asit-fenol ve kloroform uçucu ve zararlıdır. Kimyasal bir güvenlik başlığında çalışın. - 0,7 mL Toplam RNA veya IP salınımlarına 40 μL %20 SDS ekleyin. Birkaç kez kapatın ve ters çevirin. Protein çökeltisi numuneleri beyaza çevirmelidir.
- Numunelere 0,75 mL önceden ısıtılmış asit-fenol:kloroform ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve termal karıştırıcıda 1.400 RPM'de 5 dakika ve 65 ° C'de çalkalayın. Örnekleri buz üzerinde 5 dakika soğutun.
- Tüpü adım 5.1.3'ten itibaren santrifüj yapın. 2 dakika boyunca 20.000 x g'de . Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın ve 0.7 mL asit-fenol:kloroform ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın, bazen girdap yapın. 20.000 x g'de 2 dakika santrifüj. Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın ve 0.6 mL kloroform ve vorteks ekleyin.
- 20.000 x g'de 1 dakika santrifüj. Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın.
- 78 μL 3 M NaOAc, pH 5.5, 2 μL GlycoBlue ve 0.75 mL izopropanol ekleyerek nükleik asitleri çökeltin. Vorteksi 5 dakika boyunca iyice yıkın. -80 °C'de en az 1 saat veya -20 °C'de 16 saat inkübe edin.
- 20.000 x g ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peletleri buz gibi soğuk 0.75 mL% 80 etanol ile yıkayın. Kapsamlı bir yıkama için tüpleri ters çevirin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı atın.
- 450 x g, 4 °C'de 20 s boyunca döndürün ve kalan etanolleri çıkarın ve sıvıları atın. Peleti açık kapakla 65 °C'de 5 dakika kurulayın. Numuneleri aşağıdaki gibi yeniden askıya alın: IP için numuneyi 10 mM Tris-HCl, pH 7.0'ın 10 μL'sinde yeniden askıya alın. Toplam translatom analizi için, numuneyi 10 mM Tris-HCl, pH 7.0'lık 20 μL'de yeniden askıya alın.
DURMA NOKTASI: RNA -80 °C'de aylarca saklanabilir.
- 4.2.5 ve 4.3.12 adımlarındaki numuneleri buz üzerinde çözün ve 10 mM Tris-HCl pH 7.0 ile numuneleri 700 μL'lik son hacme kadar askıya alın.
- Florometri ile toplam RNA konsantrasyonunu ölçme
NOT: cDNA kütüphanesini yeni nesil dizileme için hazırlarken aşağıdaki tüm malzemeler ve yüzeyler RNaz içermeyen olmalıdır. RNA örneklerini tutarken eldiven giyin.- 1 μL asit fenol ekstrakte edilmiş toplam RNA'yı 10 mM Tris-HCl, pH 7.0'ın 9 μL'sinde seyreltin. Üreticinin web sitesinde belirtildiği gibi bir florometre kullanarak sayısallaştırın.
- 50 μg RNA içeren numuneleri 10 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7.0 ile seyreltin.
NOT: IP örneklerini ölçmeyin, bir sonraki adım için her şeyi kullanın.
- Jel saflaştırmalı ribozom korumalı ayak izi parçaları
- % 15'lik bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışma tamponuna batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 20 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
NOT: Beklenen bant boyutu 25-35 nt civarındadır. - 10 bp DNA merdivenini çözün ve örnekleri (merdiven değil) 80 ° C'de 2 dakika boyunca denatüre edin ve ardından buz üzerinde soğutun. Her numuneyi diğer tüm şeride yükleyin. Jeli 200 V'ta 50-70 dakika çalıştırın.
- 60 mL 1x TBE tamponunda 6 μL SYBR Gold (10.000 x konsantre) seyreltin ve ışık korumalı kutularda 15-20 dakika boyunca sallarken lekeleyin. Jeli boyarken, etiketli 1,5 mL tüplerde steril bir neşter ve 0,5 mL jel kırıcı tüpler hazırlayın.
- İstenilen bantları steril bir neşterle tüketin (taze bir neşter kullanın veya numuneler arasında iyice temizleyin) ve her jel parçasını bir jel kırıcı tüpe yerleştirin.
- Jelde numune kalıntısı kalmadığından emin olmak için jelin görüntüsünü alın.
- 20.000 x g'de kesilmiş dilimler içeren tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve kalan jel parçalarını jel kırıcı borudan 1,5 mL tüpe aktarın.
- 0,5 mL'lik 10 mM Tris, pH 7,0 ekleyin. 1.400 RPM'de bir termal karıştırıcıda 70 ° C'de 10 dakika boyunca çalkalayın.
- Geniş delikli pipet ucuna sahip bir selüloz asetat kolonuna aktarın ve 4 °C'de 3 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj yapın.
- Akışı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve buz üzerinde soğutun.
- Nükleik asitleri çökeltmek için şunları ekleyin: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc ve 2 μL GlikoMavi ve vorteks iyice karıştırmak için. Numuneleri en az 1 saat boyunca -80 °C'ye yerleştirin.
- 20.000 x g ve 4 °C'de en az 1 saat santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peletleri 0.75 mL buz soğuk% 80 etanol ile yıkayın. Peletler alttan ayrılana kadar iyice yıkamak için tüpleri ters çevirin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 20.000 x g'de tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- 20 s için 450 x g, 4 ° C'de döndürün ve kalan etanolleri çıkarın. Peletleri açık kapakla 65 °C'de 5 dakika kurulayın.
- 10 mM Tris, pH 7.0'dan 15 μL ekleyin ve peletleri iyice askıya alın. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
DURMA NOKTASI: Saflaştırılmış RNA birkaç ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.
- % 15'lik bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışma tamponuna batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 20 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
- Defosforilasyon
- Her numune için aşağıdaki karışımdan 3 μL kullanın: ATP'siz 2 μL 10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponuna 1 μL RNaz inhibitörü ekleyin. Her numuneye 2 μL T4 polinükleotid kinaz ekleyin. Pipetle iyice karıştırın ve titremeden 2 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Enzimi inaktive etmek için, numuneyi 10 dakika boyunca 75 ° C'de inkübe edin ve 20 s için 450 x g, 4 ° C'de aşağı doğru döndürün.
- Nükleik asidi çökeltmek için, 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA ve 55 μL 3 M NaOAc ekleyin.
- Vorteks, iyice karıştırmak ve numuneleri -80 ° C'de en az 1 saat soğutmak için vorteks.
DURMA NOKTASI: Numuneler gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklanabilir. - 5.3.11-5.3.13 arasındaki adımları yineleyin.
DURMA NOKTASI: Defosforile RNA -80 °C'de aylarca saklanabilir.
- Biyoanalizör kullanarak niceleme
- 1 μL numune ve 4 μL DEPC ile arıtılmış suyu karıştırarak her RNA numunesinin 1: 4 seyreltilmesini sağlayın.
DİKKAT: DEPC bir kanserojendir. Eldiven giyin ve dikkatli çalışın. - Bir Biyoanalizör Küçük RNA Çipi / TapeStation çalıştırın. Üreticinin protokolünü izleyin.
NOT: Beklenen ribozom korumalı RNA fragman boyutu 28-30 nt civarındadır.
- 1 μL numune ve 4 μL DEPC ile arıtılmış suyu karıştırarak her RNA numunesinin 1: 4 seyreltilmesini sağlayın.
- Linker-1 ile Ligate 3' sonu
- 5 pmol küçük RNA fragmanını 10 mM Tris, pH 7.0 ile 10 μL'ye seyreltin. Numuneleri 80 ° C'de 2 dakika boyunca denatüre edin ve buz üzerinde soğutun.
- Ana karışımı Tablo 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hazırlayın ve numune başına 29 μL kullanın.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| %50 steril filtrelenmiş PEG 8000 | 16 | 20% |
| cesaret | 4 | 10% |
| 10× T4 RNA ligaz 2 tamponu | 4 | 1 adet |
| SUPERase-In RNaz İnhibitörü | 2 | 2 U |
| 10 mM adenile bağlayıcı 3-L1 | 0.1 | 25 μM |
| DEPC ile arıtılmış su | 2.9 | |
| Son cilt | 29 |
Tablo 4: 3' uç ligasyon ana karışımı için tarif.
- 1 μL T4 RNA ligaz 2 ekleyin ve iyice karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin. 2 saat boyunca 23 °C'de inkübe edin.
- Nükleik asitleri çökeltmek için şunları ekleyin: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7.0, 55 μL 3 M NaOAc ve 2 μL GlycoBlue. Vorteksi iyice karıştırın ve numuneleri en az 1 saat boyunca -80 ° C'ye yerleştirin.
DURMA NOKTASI: Numuneleri gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklayın. - 5.3.2-5.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
- Peleti 6 μL 10 mM Tris, pH 7.0 içinde yeniden askıya alın. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de aylarca saklanabilir.
-
3' bağlantılı ayak izlerinin jel saflaştırılması
- % 10'luk bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışan tampona batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 6 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
NOT: Beklenen bant boyutu 71-73 nt civarındadır. - 5.3.2-5.3.13 arasındaki adımları yineleyin.
DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de aylarca saklanabilir.
- % 10'luk bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışan tampona batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 6 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
-
ssDNA oluşturmak için 3ʹ bağlantılı ayak izi parçalarını ters transkripte edin
- Tablo 5'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir ana karışım hazırlayın ve numune başına 3 μL kullanın.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| 10 mM dNTP'ler | 1 | 0,5 mM |
| 25 μM Bağlayıcı L(rt) | 0.5 | 625 nM |
| DEPC ile arıtılmış su | 1.5 | |
| Son cilt | 3 |
Tablo 5: Nükleik asitlerin denatürasyonundan önce ters transkripsiyon tamponu ana karışımı için tarif.
- Vorteks yapın ve numuneyi aşağı doğru döndürün.
- Numuneleri 5 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin.
- Buz üzerinde soğuk örnekler.
- Tablo 6'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir ana karışım hazırlayın ve numune başına 6 μL kullanın. Vorteks yapın ve numuneyi aşağı doğru döndürün. Her numuneye 1 μL Üst Simge III ekleyin ve iyice karıştırmak ve 50 °C'de 30 dakika boyunca inkübe etmek için hafifçe pipet ekleyin.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| 5× FS arabellek | 4 | 1 adet |
| SUPERase-In RNaz İnhibitörü | 1 | 2 U |
| DTT 0.1 milyon | 1 | 5 mM |
| Son cilt | 6 |
Tablo 6: Nükleik asitlerin denatürasyonundan sonra ters transkripsiyon tampon ana karışımı için tarif.
- RNA'yı hidrolize eden ve ters transkripsiyonu söndüren 2.3 μL 1 N NaOH ekleyin.
DİKKAT: NaOH oldukça aşındırıcıdır. Eldiven ve göz koruması kullanın. - Numune pembeye dönene kadar 95 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- % 10'luk bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışan tampona batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 23 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
NOT: Beklenen DNA bandı boyutu 115-117 nt'dir. - 5.3.2-5.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
- Peletin 10 mM Tris, pH 8.0'da 15 μL'de yeniden askıya alınması. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de aylarca saklanabilir.
-
ssDNA döngüselleştirme
- Aşağıdaki ana karışımı hazırlayın ve Tablo 7'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numune başına 4 μL yükleyin.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| 10× CircLigase II tamponu | 2 | 1 adet |
| 5 M Betain (isteğe bağlı) | 1 | 0,25 milyon |
| 50 mM MnCl2 | 1 | 2,5 mM |
| Son cilt | 4 |
Tablo 7: ssDNA sirkülarizasyon ana karışımı için tarif.
- Her numuneye 1 μL CircLigase II ssDNA ligaz ekleyin ve 60 ° C'de 1 saat inkübe edin.
NOT: Bu adımın verimliliği, 1 saatlik inkübasyondan sonra her numuneye 1 μL CircLigase II ssDNA ligaz eklenerek arttırılabilir. - 10 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe ederek enzimi etkisiz hale getirin.
- Buz üzerinde soğutun ve PCR amplifikasyonuna devam edin veya -80 ° C'de saklayın.
DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de yıllarca saklanabilir.
-
PCR amplifikasyonu
- Aşağıdaki PCR ana karışımını hazırlayın ve Tablo 8'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numune başına 82 μL yükleyin.
| Reaktif | Numune başına miktar (μL) | Son konsantrasyon |
| DEPC ile arıtılmış su | 61.6 | |
| 5× Phusion HF reaksiyon tamponu | 17.6 | 1 adet |
| 10 mM dNTP'ler | 1.8 | 200 μM |
| 100 μM PCR ileri astar | 0.2 | 225 nM |
| HF Phusion polimeraz | 0.8 | 1.6 U |
| Son cilt | 82 |
Tablo 8: PCR amplifikasyon master karışımı için tarif.
- Ana karışım içeren her tüpe, 5 μL dairesel DNA ekleyin.
NOT: Dairesel DNA örneklerinin geri kalanını -80 ° C'de saklayın. - Her numuneye farklı bir 1 μL 20 μM PCR ters barkod astarı ekleyin (bkz. Tablo 9) ve iyice karıştırmak için vorteks.
- Her tüpü dört ayrı PCR tüpüne ayırın, her biri farklı sayıda PCR döngüsü için kullanılacaktır.
- Tablo 10'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi aşağıdaki programa göre bir PCR reaksiyonu çalıştırın.
| Devir | Denatüre (98 °C) | Tavlama (60 °C) | Uzatma (72 °C) |
| 1 | 30 Saniye | ||
| 2-16 | 10 Saniye | 10 Saniye | 5 sn. |
Tablo 10: PCR reaksiyonu için PCR programı.
- 8, 9, 10 ve 11. döngülerden sonra ilk deneme olarak PCR tüplerini çıkarın (IP örnekleri için döngüler 9 ila 15 arasında değişir). Her döngüden sonra, programı duraklatın, bir aliquot çıkarın ve buza koyun ve ardından programı hızla devam ettirin.
NOT: Döngü sayısı, her reaksiyondaki dairesel DNA miktarına göre ayarlanmalıdır. Bir örnek ve daha fazla açıklama için Şekil 4'e bakın. - Her 17 μL reaksiyona, 3.5 μL 6x DNA yükleme boyası ekleyin.
- 10 bp DNA merdivenini çözün.
- Jel-elektroforez ile boyut ayrımı için,% 8 TBE poliakrilamid 1x TBE çalışma tamponuna batırın ve her farklı döngü numarasının numunelerini bitişik kuyucuklara yükleyin ve jeli 180 V'ta 50 dakika boyunca çalıştırın.
- 60 mL 1x TBE tamponunda 6 μL SYBR Gold (10.000 x konsantre) seyreltin ve ışık korumalı kutularda 15-20 dakika boyunca sallarken lekeleyin.
- Jeli boyarken, etiketli 1,5 mL tüplerde steril bir neşter ve 0,5 mL jel kırıcı tüpler hazırlayın.
- Lekeli nükleik asitlerin görüntüsünü alın.
- İstenilen bandı steril neşter ile beklenen 174-176 bp bant boyutunda kesin ve jel dilimini hazırlanan 0,5 mL jel kırıcı tüpe yerleştirin (numuneler arasında iyice temizleyin ve RNase inaktive edici madde kullanın veya yeni bir bıçağa geçin).
- Tüpleri 20.000 x g ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından kalan jel parçalarını 0,5 mL jel kırıcı tüpünden 1,5 mL tüpe aktarın.
- 500 μL 10 mM Tris, pH 8.0 ekleyin ve 1.400 RPM'de termal karıştırıcıda 10 dakika ve 70 °C boyunca çalkalayın.
- Çözünmüş jeli, geniş delikli pipet ucuna sahip bir selüloz asetat kolonuna aktarın.
- Kolonu 20.000 x g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve akışı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve buz üzerinde soğutun.
- Nükleik asidi çökeltmek için şunu ekleyin: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0.5 M EDTA ve 2 μL GlikoMavi ve vorteks iyice karıştırmak için.
- Numuneleri -80 °C'de en az 1 saat veya gece boyunca -20 °C'de saklayın.
DURMA NOKTASI: Numuneler gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklanabilir. - 5.3.11-5.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
- 10 mM Tris'in 11 μL'sinde yeniden askıya alın, pH 8.0. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de yıllarca saklanabilir.
-
Biyoanalizör ile boyut dağılımını ölçme
- 1 μL numuneyi 4 μL DEPC ile arıtılmış su ile karıştırarak her numunenin 1:4 seyreltilmesini sağlayın.
- Bioanalyzer Small RNA Chip'i çalıştırın. Üreticinin protokolünü izleyin.
NOT: Beklenen uzunluk 175 ± 5 bp'dir.
-
DNA konsantrasyonunu florometre ile ölçün
- Üreticinin tavsiyelerine göre bir florometre ile dsDNA yüksek hassasiyetli konsantrasyon kontrolü yapın.
- Illumina tavsiyelerine göre çok sayıda ve dizi numunesi (Index Adapters Pooling Guide12).
6. Veri analizi
- Ek dosyada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analiz gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün akış şemasında gösterildiği gibi (Şekil 1), hücreler log fazına büyütüldü ve daha sonra filtrasyon ile hızlı bir şekilde toplandı ve kriyojenik öğütme ile lize edildi. Lisat daha sonra ikiye ayrıldı: biri toplam ribozom korumalı mRNA ayak izleri için, diğeri ise etiketli protein-ribozom-yeni doğan zincir komplekslerini aşağı çekmek için afinite saflaştırması yaptığımız seçilmiş ribozom korumalı mRNA ayak izleri için. Şekil 2'de görülebileceği gibi, etiketli protein ekspresyonunu ve batı leke analizi ile aşağı çekmenin başarısını sağladık. Sistem el kitabına göre, tipik olarak 20-45 nt uzunluğunda olan ribozom korumalı ayak izlerinin izolasyonunu, küçük RNA elektroforezi (2100 BioAnalyzer sistemi) ile doğruladık ve boyut algılamada 5-10 nt kaymaya izin verdik (Şekil 3). Daha sonra, derin dizileme ve büyük veri analizi için bir cDNA kütüphanesi oluşturduk. cDNA kütüphanesini oluştururken, düşük döngünün düşük verime yol açabileceğini unutmayın ( Şekil 3'teki şerit 2'de görülebileceği gibi), ancak oluşturulan kütüphaneyi kurtarmak için yeniden amplifikasyonun mümkün olduğunu unutmayın. PCR primerleri tükendiğinde aşırı döngü meydana gelebilir, ancak reaksiyon devam eder. dNTP'ler hala mevcut olduğunda, reaksiyon devam eder ve PCR ürünlerinin kendilerini13'e hazırlaması nedeniyle kimerik dizilerle daha uzun PCR artefaktları üretir (görünür yayma ile gösterilen Şekil 3'teki 3-4 şeritlerinde görülebileceği gibi). dNTP'lerin konsantrasyonu da sınırlayıcı hale gelirse, yalnızca kısmen homolog kütüphane parçalarından oluşan heterodublekslerin varlığını gösteren ürünler ortaya çıkabilir. Şekil 4 bir referans görevi görür, şerit 2 optimum amplifikasyonu temsil eder ve şerit 3 kabul edilebilir bir amplifikasyondur. Şerit 4 ve 5'ten (döngü 10 ve 11) örnekler, PCR kopyaları ve eserleri ekleme olasılığı nedeniyle kullanılmamalıdır. Oluşturulan kütüphane, tam boyut dağılımı ve niceliği için yüksek hassasiyetli DNA elektroforezi (aynı BioAnalyzer sistemi kullanıldı) ile doğrulandı (Şekil 5). 3' uç bağlayıcı ligasyonu, ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonundan sonra, 175 nt civarında keskin bir tepe noktası ile böyle bir cDNA uzunluk dağılımı beklenir.
Sıralı kütüphaneden adaptörleri ve barkodları kırpıp çıkardık ve daha fazla analiz için yalnızca 20 ila 45 nt arasındaki okumalar seçildi. Şekil 6 , ortaya çıkan uzunluk dağılımını göstermektedir. Okumalar farklı gruplara ayrıldı: kodlama dizileri, intronlar ve intergenik diziler (Şekil 7) ve ayrıca Şekil 8'de gösterildiği gibi sınıflandırıldı.
Kotranslasyonel etkileşimlerin tespiti ve karakterizasyonu için son analiz, ribozom korumalı mRNA fragmanlarının zenginleştirilmesine dayanarak yapıldı ve Şekil 9'daki grafikler üretildi. Toplam translatomun normalleştirilmiş ribozom doluluğunu (her küre boyunca her nükleotidde) karşılık gelen seçilmiş translatomla (nazen-interaktom) karşılaştırdık. Nükleotid başına karşılaştırma, çeviri oranları artefaktlarını ortadan kaldırır. Biyolojik replikalar arasındaki tekrarlanabilirlik Pearson korelasyonu ile değerlendirildi (eşik > 0.6). Vma2p'nin üç protein ile ko-translasyonel etkileşimlerini analiz eden Seçici Ribozom Profillerini sunuyoruz: ribozom ile ilişkili şaperon Ssb1p, Pfk2p (Fosfofruktokinaz) ve Fas1p (Yağ asidi sentazı), her protein C' GFP tarafından terminal olarak etiketlenmiştir. Protokolü biyolojik replikasyonlarda gerçekleştirdik. Şekil 9 A, D ve G, her bir afinite saflaştırmasının deneysel şemasını gösterir. Daha sonra, Vma2p orf boyunca Ssb1 interaktomlarına kıyasla toplam translatomların ribozom doluluğunu göstereceğiz ve vakuolar H + -ATPaz'ın bir alt birimini kodluyoruz (Şekil 9 B, E ve H). Son olarak, orf boyunca [kodon / aa] içindeki her ribozom pozisyonunda oran tabanlı ribozom zenginleştirme profillemesi (IP / Toplam) gerçekleştirdik (Şekil 9 C, F ve I). Bu üç proteinin birlikte translasyonel etkileşimlerini ribozom tarafından sentezlenen Vma2p ile karşılaştırmak, Ssb1 şaperonunun, SeRP tarafından dört önemli zenginleştirme zirvesi belirlediğimiz gibi , orf boyunca dört farklı bölgede yeni ortaya çıkan Vma2p'yi meşgul ettiğini ortaya koydu. Farklı olarak, Pfk2p, SeRP tarafından tanımlandığı gibi, ko-translasyonel şaperon Ssb1'e kıyasla farklı bir konumda sadece bir önemli zenginleştirme zirvesi göstermektedir. yeni ortaya çıkan Vma2p ile Fas1 ko-translasyonel etkileşimlerinin analizi, herhangi bir önemli zenginleştirme tespit etmemiştir. Bu nedenle, bu oran bazlı zenginleştirme ribozom profillerinin karşılaştırılması, bu protokolün yakın kodon çözünürlüğündeki çeşitli ko-translasyonel etkileşimlerin tespiti ve karakterizasyonundaki gücünü göstermektedir.
Şekil 2: BY4741 suşunun HA etiketli Naa10 ile afinite saflaştırılmasından sonra temsili batı lekesi sonucu. BY4741 suşunun afinite saflaştırılmasından sonra temsili batı lekesi sonucu, HA etiketli Naa10 ile 27.8 kDa civarında bir bant gösterirken, vahşi tip, negatif bir kontrol olarak, bant göstermez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ayak izi izolasyonu ve asit-fenol: kloroform ile RNA ekstraksiyonundan sonra temsili BioAnalyzer sonucu ve ortalama 25 nt. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: PCR amplifikasyonunun temsili jel-elektroforezi. 8-11 döngülerinden PCR ürünleri ile yüklü 2-5 şeritli PCR amplifikasyonunun temsili jel-elektroforezi ve her iki taraftaki merdivenler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bir cDNA kütüphanesinin oluşturulmasını takiben elde edilen Temsili BioAnalyzer sonucu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Adaptörlerin Cutadapt ile çıkarılmasından sonra okumaların beklenen uzunluk dağılımı (20'den kısa veya 45'ten uzun okumaların kaldırılması). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Bowtie2 ile kodlamayan RNA okumalarını kaldırdıktan ve kalan okumaları farklı organizmalara hizalamak için TopHat'ı kullandıktan sonra beklenen hizalama başarı yüzdesi. Numune S. cerevisiae'den (BY4741'in mutasyona uğramış bir varyantı) alınmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: RiboToolkit ile oluşturulan ve okumalardaki rRNA öğelerini kaldırmak için Bowtie2 kullandıktan sonra hizalanmış okumaların beklenen kodlama ve kodlama dışı oranını temsil eden bir grafik. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Üç farklı proteinin birlikte translasyonel etkileşimleri: Ssb1p, Pfk2p ve Fas1p, ribozom tarafından sentezlenen, SeRP tarafından analiz edilen Vma2p ile. Tüm y eksenleri milyon okuma başına okuma (RPM) olarak gösterilir. (A, D, G) Sırasıyla GFP tarafından terminal olarak etiketlenmiş Ssb1p, Pfk2p ve Fas1p C' SeRP'nin deneysel şeması. (B, E, H) Toplam translatomların orfu boyunca ribozom doluluğu, sırasıyla Ssb1, Pfk2p ve Fas1p interaktomlarına kıyasla (biyolojik replikasyonlarda). (C, F, I) Orf boyunca [kodon / aa] içindeki her ribozom pozisyonunda sırasıyla Ssb1p, Pfk2p ve Fas1p'nin (IP / Toplam oran) ortalama zenginleşmesi. Biyolojik replikalar arasındaki varyasyon, gölgeli alan ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 9: 3' Linker ve primer dizileri. 3' Linker L1: 5ʹ adenilasyon ve 3ʹ dideoksi-sitidin benzersiz moleküler tanımlayıcılara sahip Linker 3-L1 ('NN...') (RNaz içermeyen HPLC saflaştırma; Ters transkripsiyon bağlayıcısı: 5ʹ fosforile edilmiş, benzersiz moleküler tanımlayıcılara sahip ters transkripsiyon (L(rt)) (RNaz içermeyen HPLC saflaştırma); PCR ileri astar: PCRf; HPLC saflaştırılmış. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, protokol, yakın kodon çözünürlüğünde ko-translasyonel etkileşimleri yakalamak için Seçici Ribozom Profilleme yaklaşımını detaylandırmaktadır. Ribozom, kalabalık sitoplazmaya yeni zincir oluşumunu koordine etmek için bir merkez olarak yükseldiğinden, bu, fonksiyonel bir proteom sağlamak ve çeşitli hastalıkları incelemek için gereken çeşitli ko-translasyonel etkileşimleri tanımlamak ve karakterize etmek için çok önemli bir yöntemdir. Bugüne kadar, SeRP bu etkileşimleri doğrudan bir şekilde, in vivo14,15,16 olarak yakalayabilen ve karakterize edebilen tek yöntemdir.
İlk ve en kritik adım hücre toplama ve lizistir. Saniyeler içinde, devam eden çeviriyi, flaş dondurma ve ardından donmuş halde lizis ile yakalamak zorunludur. Ribozomal akıntıyı önlemek ve hızlı bir şekilde ortaya çıkabilen stres translasyonel tepkilerini indüklemek için hücre toplama aceleyle yapılmalıdır. İkinci kritik adım, afinite saflaştırma adımıdır. Sıkı yıkama ile arka plan bağlanmasını azaltmak zorunludur, aynı zamanda in vivo çapraz bağlama ile kolaylaştırılabilecek eş-translasyonel etkileşimlerin korunduğundan emin olun. Bu protokol son derece hassas NGS'ye (Yeni Nesil Dizileme) dayandığından, ilk adımlardaki yüksek arka plan, aşağıdaki cDNA kütüphanesi hazırlama adımlarında güçlendirilebilir ve bu da düşük sinyal-gürültü oranlarına yol açar.
Nükleaz tedavisi, korunmayan tüm mRNA'ları sindirmek için, RNA sindiriminin üstünde veya altında önlenmesi için izole ribozomal ayak izlerinin boyut dağılımının (yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi) dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi ile birlikte polizom profillemesi17 ile değerlendirilmelidir. Nükleaz konsantrasyonunun ve sindirim sürelerinin kalibrasyonu, doğru ayak izi geri kazanımını kolaylaştırabilir, çünkü aşırı sindirim ribozomal rRNA sindirimine yol açarak ribozom korumalı ayak izlerinin kaybına yol açabilir. Yetersiz sindirimin, ribozom korumalı ayak izlerinin daha düşük keşif oranlarına da yol açabileceğine dikkat etmek önemlidir, çünkü cDNA kütüphanesi hazırlama adımları ve burada açıklanan veri analizi adımları uzun, karakteristik olmayan okumaları atar.
rRNA tükenmesi her zaman kritik bir adım oluşturmasa ve zorunlu olmasa da, daha temiz örnekler ve dolayısıyla daha yüksek genom haritalı okuma oranı gibi bazı avantajlara sahiptir. Öte yandan, önyargı olasılığı vardır, çünkü birçok rRNA tükenme protokolü de istenen ribozom korumalı parçaların tükenmesine neden olabilir. rRNA tükenme kitlerinin maliyetleri de dikkate alınmalıdır. rRNA tükenmesi, ribozom-ayak izi izolasyon adımından sonra veya cDNA daireselleştirme adımından sonra gerçekleştirilebilir.
Burada açıklandığı gibi cDNA kütüphanesi hazırlama adımları, düşük mRNA girişi için optimize edilmiştir, çünkü afinite ve ribozom saflaştırma adımları, RNA-seq ekspresyon çalışmalarına kıyasla mRNA giriş miktarını yüksek oranda azaltır. Hücre kültürlerinin başlangıç miktarını yükseltmek, cDNA kütüphanesi oluşumunu büyük ölçüde kolaylaştırabilir. Alternatif olarak, tercih edilen herhangi bir cDNA kütüphanesi protokolü, burada açıklanan afinite saflaştırma ve ayak izi izolasyon adımlarına uyabilir. Ribozomal ayak izlerini oluşturan Nükleaz tedavisinin, burada seçtiğiniz protokolde açıklanan cDNA protokolünde aşağıdaki bağlayıcı ligasyon adımlarına izin vermek için ortaya çıkan mRNA uçlarının onarımını (cDNA kütüphanesi hazırlığı, Defosforilasyon adımı) gerektirdiğini belirtmek önemlidir.
Dizileme sırasında, SeRP'yi RNA-Seq'ten ayırt etmek önemlidir, çünkü üretilen kütüphanelerin heterojenliği, afinite etiketli faktörlere bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Moleküler şaperonlar ve hedefleme faktörleri genellikle bağlanmada daha karışıktır, çeviri sırasında yüzlerce veya binlerce substratla etkileşime girer ve bu da çok çeşitli cDNA kütüphanelerine yol açar. Bununla birlikte, ko-translasyonel karmaşık montaj interaktörleri gibi oldukça spesifik interaktörler genellikle çok daha az çeşitli cDNA kütüphanelerinin oluşturulmasına yol açabilir. Aynı şeritteki çeşitli ve çeşitli olmayan kütüphanelerin ani artışı, sıralamayı ve veri analizi sonuçlarını takip etmeyi büyük ölçüde iyileştirebilir.
SeRP'nin bir diğer benzersiz özelliği, orf boyunca ribozom doluluklarındaki yerel varyasyonları yakalama yeteneğidir ve her bir etkileşim kümesiyle ilişkili çeviri hızındaki ribozomal kaymaların keşfine izin verir. Bu nedenle, zenginleştirmeyi doğru bir şekilde tanımlamak için orf boyunca her bir kodondaki ribozom doluluklarını karşılaştırmak zorunludur. Orf ortalamalarını kullanmak, geçici etkileşimlerin kaybına veya yanlış keşiflere yol açabilir.
SeRP yönteminin doğru kullanımı, yeni mekanik özelliklerin yanı sıra yeni ribozomla ilişkili faktörleri keşfederek protein-biyosentez alanında devrim yaratan, doğrudan analize birçok eş-translasyonel yol açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Verimli tartışmalar için tüm laboratuvar üyelerine ve makalenin eleştirel okuması için Muhammed Makhzumy'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma ISF (İsrail Bilim Vakfı) hibe 2106/20 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide | IDT | custom order | RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3' |
| Absolute ethanol | VWR | 20821 | |
| Acid phenol–chloroform | Ambion | AM9722 | |
| Antibody: mouse monclonal anti-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
| Aprotinin | Roth | A162.3 | |
| ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
| Bacto agar | BD | 214030 | |
| Bacto peptone | BD | 211820 | |
| Bacto tryptone | BD | 211699 | |
| Bacto yeast extract | BD | 212720 | |
| Bestatin hydrochloride | Roth | 2937.2 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| CircLigase II ssDNA Ligase* | Epicentre | CL9025K | 100 U/μL |
| Colloidal Coomassie staining solution | Roth | 4829 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 29384100 | |
| Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
| DEPC treated and sterile filtered water* | Sigma | 95284 | |
| D-Glucose anhydrous | Merck | G5767-500G | |
| Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
| Dimethylsulfoxide* | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
| DNA loading dye* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6× |
| DNase I, recombinant | Roche | 4716728001 | RNAse free |
| dNTP solution set* | NEB | N0446S | |
| EDTA* | Roth | 8043 | |
| Glycerol | VWR | 24388.260. | |
| Glycine solution | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
| GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/mL |
| HEPES | Roth | HN78.3 | |
| HF Phusion polymerase* | NEB | M0530L | |
| HK from S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
| Hydrochloric acid | AppliChem | A1305 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Roth | CN08 | |
| Kanamycin | Roth | T832.4 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
| Linker L(rt) | IDT | custom order | |
| Liquid nitrogen | |||
| MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
| Na2HPO4·2H2O | Roth | T879.3 | |
| NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
| NaH2PO4·H2O | Roth | K300.2 | |
| NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads | GE Life Sciences | 17090601 | |
| Nonidet P 40 substitute | Sigma | 74385 | |
| Pepstatin A | Roth | 2936.2 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride | Roth | 6367 | |
| Precast gels | Bio-Rad | 5671034 | 10% and 12% |
| RNase I | Ambion | AM2294 | |
| SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNase free |
| Sodium acetate* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5.5 |
| Sodium azide | Merck | S8032-100G | |
| Sodium chloride | Roth | 9265 | |
| Sodium hydroxide* | Sigma | S2770 | 1 N |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
| Superscript III Reverse Transciptase* | Invitrogen | 18080-044 | |
| SYBR Gold* | Invitrogen | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase* | NEB | M0201L | |
| T4 RNA ligase 2* | NEB | M0242L | |
| TBE polyacrylamide gel* | Novex | EC6215BOX | 8% |
| TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC68752BOX | 10% |
| TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC6885BOX | 15% |
| TBE–urea sample buffer* | Novex | LC6876 | 2× |
| Tris | Roth | 4855 | |
| Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7.0 |
| Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8.0 |
| UltraPure 10× TBE buffer* | Invitrogen | 15581-044 | |
| * - for library preparation | |||
| gasket and spring clamp , 90 mm, | Millipore | XX1009020 | |
| ground joint flask 1 L , | Millipore | XX1504705 |
References
- Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
- Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
- Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
- Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
- Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
- Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
- Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
- Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
- Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
- Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
- Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
- Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).
