Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den intestinalen murinen Organoiden unter Verwendung qualitativer Bildgebung und quantitativer Zytometrie-Assays. Diese Arbeit kann möglicherweise auf andere fluoreszierende Sonden ausgedehnt werden, um die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf ROS zu testen.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intestinalen Homöostase. ROS sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie werden als Reaktion auf Infektionen oder Verletzungen auf Schleimhautebene produziert, da sie an antimikrobiellen Reaktionen und Wundheilung beteiligt sind. Sie sind auch kritische sekundäre Botenstoffe, die mehrere Wege regulieren, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung. Auf der anderen Seite führen übermäßige ROS-Spiegel zu oxidativem Stress, der für Zellen schädlich sein kann und Darmerkrankungen wie chronische Entzündungen oder Krebs begünstigt. Diese Arbeit bietet eine einfache Methode zum Nachweis von ROS in den murinen Organoiden des Darms durch Live-Bildgebung und Durchflusszytometrie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen fluorogenen Sonde. Hier beschreibt das Protokoll die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen, die das Redoxgleichgewicht in Darmorganoiden modulieren und ROS-Spiegel in bestimmten Darmzelltypen nachweisen, veranschaulicht hier durch die Analyse der mit GFP genetisch markierten Darmstammzellen. Dieses Protokoll kann mit anderen Fluoreszenzsonden verwendet werden.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie können auch aktiv durch spezialisierte enzymatische Komplexe wie die membrangebundenen NADPH-Oxidasen (NOX) und Dual-Oxidasen (DUOX) hergestellt werden, die Superoxidanion und Wasserstoffperoxid1 erzeugen. Durch die Expression von antioxidativen Enzymen und ROS-Aasfressern können Zellen ihr Redoxgleichgewicht fein abstimmen und so die Gewebehomöostase schützen2. Obwohl ROS für die Zellen hochgiftig sein und DNA, Proteine und Lipide schädigen kann, sind sie entscheidende Signalmoleküle2. Im Darmepithel sind moderate ROS-Spiegel für die Proliferation von Stamm- und Vorläuferzellen erforderlich3; hohe ROS-Werte führen zu ihrer Apoptose4. Chronischer oxidativer Stress ist mit vielen Magen-Darm-Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen oder Krebs verbunden. In einem Mausmodell für Wnt-getriebenen Darmkrebs wurde beispielsweise festgestellt, dass eine erhöhte ROS-Produktion durch Aktivierung von NADPH-Oxidasen für die Hyperproliferation von Krebszellen erforderlich ist5,6. Zu definieren, wie Darmzellen, insbesondere Stammzellen, Stammzellen mit oxidativem Stress umgehen und wie die zelluläre Umgebung diese Kapazität beeinflussen kann, ist wichtig, um die Ätiologie dieser Krankheit besser zu verstehen7.
In einem Gewebe weisen verschiedene Zelltypen einen basalen oxidativen Zustand auf, der je nach ihrer Funktion und ihrem Stoffwechsel und der Expression unterschiedlicher Mengen an oxidativen und antioxidativen Molekülen variieren kann4,7. Die Überwachung von ROS in vivo ist eine große Herausforderung. Zellpermeable Farbstoffe, die Fluoreszenz entsprechend ihrem Redoxzustand emittieren, wurden entwickelt, um zelluläre ROS in lebenden Zellen und Tieren sichtbar zu machen und zu messen. Ihre Wirksamkeit hängt jedoch von ihrer Diffusion in lebenden Geweben und ihrer schnellen Auslesung ab, was ihre Verwendung in Tiermodellen erschwert8.
In der Vergangenheit wurde die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen auf die ROS-Erzeugung unter Verwendung von Zelllinien durchgeführt, was jedoch möglicherweise nicht die In-vivo-Situation widerspiegelt. Das darmorganoide Modell, das von der Gruppe von Clevers9 entwickelt wurde, ermöglicht das Wachstum von intestinalen Primärzellen ex vivo. Die Kultur von Darmkrypten in Matrizen führt in Gegenwart definierter Wachstumsfaktoren zu dreidimensionalen Strukturen, organoiden (Mini-Darm) genannten Strukturen, die die Krypten-Zotten-Organisation reproduzieren, wobei Zellen aus den verschiedenen Epithellinien ein inneres Lumen auskleiden und die Darmstammzellen in kleinen kryptenartigen Vorsprüngen leben.
Hier wird unter Ausnutzung dieses Modells eine einfache Methode beschrieben, um oxidativen Stress in primären Darmzellen mit der Einzelzellauflösung zu untersuchen, indem ein kommerziell erhältlicher ROS-sensitiver Farbstoff in das Organoidkulturmedium gegeben wird.
Plattenleser werden häufig verwendet, um die ROS-Produktion in einer Gesamtpopulation zu erkennen. Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie oder bildgebende Assays, um ROS in einem bestimmten Zelltyp mit genetisch veränderten Zellen oder spezifischer Antikörperfärbung nachzuweisen. Diese Arbeit umfasst die intestinale Organoidkultur der Maus und die ROS-Visualisierung durch konfokale Bildgebung und Quantifizierung durch Durchflusszytometrie. Mit Lgr5-GFP-Mäuse-abgeleiteten Dünndarm-Organoiden ist es möglich, das Niveau des oxidativen Stresses in Darmstammzellen nach verschiedenen Behandlungen spezifisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um den Einfluss exogener Moleküle, wie z. B. mikrobiota-abgeleitetes Muramyl-Dipeptid (MDP)10, auf die ROS-Waage zu testen, nachdem Organoide mit den ausgewählten Verbindungen stimuliert wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung muriner Jejunalkrypten, zur Kultivierung zu 3D-Organoiden und zur Analyse von ROS in Organoiden durch Kombination einer ROS-empfindlichen fluorogenen Sonde mit qualitativer Mikroskopiebildgebung ganzer Organoide und quantitativer ROS-Messung mittels Durchflusszytometrie an einzelnen Zellen nach Organoiddissoziation.
Der erste kritische Schritt in dieser Methode ist das Extraktionsverfahren für Krypten. In der Tat ist die Qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss 17-CE14-0022 (i-Stress) der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) unterstützt.
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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