반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석
Summary
본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.
Abstract
반응성 산소 종 (ROS)은 장 집상성에서 필수적인 역할을합니다. ROS는 세포 대사의 천연 부산물입니다. 그들은 항균 반응 및 상처 치유에 관여로 점막 수준에서 감염 또는 부상에 대 한 응답으로 생산 됩니다. 그(것)들은 또한 세포 성장 및 분화를 포함하여 몇몇 통로를 통제하는 중요한 이차 메신저입니다. 다른 한편으로는, 과도한 ROS 수준은 산화 스트레스로 이끌어 내고, 이는 세포에 대한 해로운 일 수 있고 만성 염증 또는 암 같이 장 질병을 선호할 수 있습니다. 이 작품은 상업적으로 이용 가능한 불소 성 프로브를 사용하여 살아있는 화상 진찰 및 유동 세포측정에 의하여 장 내 뮤뇨 오르가노이드에서 ROS를 검출하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 프로토콜은 장 가구형에서 레독스 균형을 조절하고 특정 장 세포 유형에서 ROS 수준을 검출하는 화합물의 효과를 분석하며, 여기에 GFP로 유전적으로 표지된 장 줄기 세포의 분석에 의해 예시된다. 이 프로토콜은 다른 형광 프로브와 함께 사용될 수 있다.
Introduction
반응성 산소 종 (ROS) 세포 대사의 자연 부산물. 또한 초산화화물 음이온 및 과산화수소를 생성하는 멤브레인 바인딩 NADPH-Oxidases (NOX) 및 듀얼 옥시다제 (DUOX)와 같은 특수 효소 복합체에 의해 적극적으로 생성 될 수 있습니다. 항산화 효소와 ROS 청소부를 발현함으로써 세포는 레독스 균형을 미세조정하여 조직 항상성을 보호할 수 있습니다2. ROS는 세포에 매우 독성이 있고 DNA, 단백질 및 지질을 손상시킬 수 있지만 중요한 신호 분자2입니다. 장 상피에서, 중간 정도의 ROS 수준은 줄기 및 전구 세포 증식에 필요합니다3; 높은 ROS 수준은 그들의 apoptosis4로 이끌어 내는. 만성 산화 스트레스는 염증성 장 질환이나 암과 같은 많은 위장 질환과 관련이 있습니다. 예를 들어, Wnt 구동 장암의 마우스 모델에서 NADPH-산화제의 활성화를 통한 ROS 생산이 상승하여 암세포 과확산5,6에 요구되는 것으로 나타났다. 장 세포, 특히 줄기 세포가 산화 스트레스를 관리하는 방법과 세포 환경이이 용량에 미치는 영향을 정의하는 것은이 질병의 병인을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다7.
조직에서, 다른 세포 모형은 그들의 기능 및 물질 대사 및 산화제 와 항 산화 분자의 다양한 수준의 표현에 따라 다를 수 있는 기저 산화 상태를 제시4,7. 생체 내에서 ROS를 모니터링하는 것은 매우 어렵습니다. 그들의 redox 상태에 따라 형광을 방출하는 세포 투과성 염료는 살아있는 세포 및 동물에 있는 세포 ROS를 구상하고 측정하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 그들의 효능은 살아있는 조직 내부의 확산과 그들의 급속한 판독에 따라 달라 집니다., 동물 모델에서 사용 하기 어려운 만들기8.
과거에는, ROS 생성에 화합물의 효과의 연구는 세포주를 사용하여 수행되었지만, 이것은 생체 내 상황을 반영하지 않을 수 있다. Clevers9의 그룹에 의해 개발된 장 기관지성 모델은 장 1차 세포의 성장을 가능하게 합니다. 행렬에서 장 토굴의 문화, 정의 된 성장 인자의 존재, 3 차원 구조로 이어질, 라는 오가노이드 (미니 창자), 이는 내부 루멘을 안감 다른 상피 혈통에서 세포와, 그리고 소장 줄기 세포는 작은 crypts 같은 돌출에 거주.
여기서, 본 모델을 활용하면, 단세포 배양 배지에 상업적으로 이용 가능한 ROS 에 민감한 염료를 첨가함으로써 단세포 분해능에서 1차 장 세포에서 산화적 스트레스를 연구하는 간단한 방법이 기재된다.
플레이트 판독기는 종종 총 인구에서 ROS 생산을 감지하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 유동 세포 분석 또는 이미징 분석체를 사용하여 유전자 변형 세포 또는 특정 항체 염색을 가진 특정 세포 유형에서 ROS를 검출합니다. 이 작품은 유동 세포측정에 의한 공초점 화상 진찰 및 정량화에 의한 마우스 장 기관가성 배양 및 ROS 시각화를 포함합니다. Lgr5-GFP 마우스 유래 소장 오르가노이드를 사용하여, 상이한 치료법에 따라 장 줄기 세포에서 산화 스트레스의 수준을 구체적으로 분석할 수 있다. 이러한 프로토콜은 선택된 화합물로 오르가노이드를 자극한 후 ROS 균형에 미생물-유래 무라밀-디펩티드(MDP)10과 같은 외인성 분자의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 뮤직 제주네아네아의 토굴을 분리하고, 3D 오르간노이드로 배양하고, ROS에 민감한 플루오로겐성 프로브를 전체 오르가노이드의 질적 현미경 영상과 결합하여 오르가노이드 변화 후 단일 세포에 대한 유동 세포측정을 사용하여 분석하는 단계별 프로토콜을 제공한다.
이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 암호화 추출 프로시저입니다. 실제로, 토굴 준비의 품질은 성공?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 보조금 17-CE14-0022 (i-스트레스)에 의해 지원되었다.
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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