Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles
Summary
Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.
Abstract
Les champignons entomopathogènes (FPE) sont l’un des agents de lutte microbienne pour la lutte intégrée contre les ravageurs. Pour lutter contre les ravageurs locaux ou envahissants, il est important d’isoler et de sélectionner les FPE indigènes. Par conséquent, la méthode de l’appât du sol combinée au système d’appât d’insecte (ver de farine, mouoliteur Tenebrio) a été utilisée dans cette étude avec quelques modifications. Les EPF isolés ont ensuite été soumis au test de virulence contre le ravageur agricole Spodoptera litura. De plus, les souches EPF potentielles ont été soumises à des identifications morphologiques et moléculaires. En outre, la production de conidies et le test de thermotolérance ont été effectués pour les souches EPF prometteuses et comparés; ces données ont ensuite été substituées dans la formule du nombre de conidies effectives (ECN) pour le classement en laboratoire. Le système appât-ver de farine du sol et la formule ECN peuvent être améliorés en remplaçant les espèces d’insectes et en intégrant plus de facteurs de stress pour l’évaluation de la commercialisation et l’application sur le terrain. Ce protocole fournit une approche rapide et efficace pour la sélection des FPE et améliorera la recherche sur les agents de lutte biologique.
Introduction
Actuellement, les champignons entomopathogènes (FPE) sont largement utilisés dans la lutte microbienne contre les ravageurs agricoles, forestiers et horticoles. Les avantages de l’EPF sont ses larges gammes d’hôtes, sa bonne adaptabilité environnementale, sa nature écologique et le fait qu’il peut être utilisé avec d’autres produits chimiques pour montrer l’effet synergique de la lutte intégrée contre les ravageurs1,2. Pour l’application en tant qu’agent antiparasitaire, il est nécessaire d’isoler un grand nombre d’EPF des insectes malades ou de l’environnement naturel.
L’échantillonnage de ces organismes à partir de leurs hôtes aide à comprendre la répartition géographique et le taux de prévalence de la FPE chez les hôtes naturels3,4,5. Cependant, la collecte d’insectes infectés par des champignons est généralement limitée par des facteurs environnementaux et des populations d’insectes sur le terrain4. Étant donné que les insectes hôtes meurent après une infection par le FPE et tombent ensuite dans le sol, l’isolement du FPE à partir d’échantillons de sol pourrait être une ressource stable3,6. Par exemple, les saprophytes sont connus pour utiliser l’hôte mort comme ressource pour la croissance. Les systèmes d’appâts de sol et de milieux sélectifs ont été largement utilisés pour détecter et isoler les FPE du sol3,4,7,8,9,10.
Dans la méthode du milieu sélectif, la solution de sol diluée est plaquée sur un milieu contenant des antibiotiques à large spectre (p. ex. chloramphénicol, tétracycline ou streptomycine) pour inhiber la croissance des bactéries2,3,9,11. Cependant, il a été rapporté que cette méthode peut déformer la diversité et la densité de la souche et peut provoquer une surestimation ou une sous-estimation de nombreuses communautés microbiennes6. De plus, les souches isolées sont moins pathogènes et rivalisent avec les saprophytes pendant l’isolement. Il est difficile d’isoler le PEF de la solution de sol diluée3. Au lieu d’utiliser un milieu sélectif, la méthode d’appât du sol isole l’EPF des insectes morts infectés, qui peuvent être stockés pendant 2-3 semaines, fournissant ainsi une méthode de séparation EPF plus efficace et standard3,4,7,6. Parce que la méthode est facile à utiliser, on peut isoler une variété de souches pathogènes à faible coût4. Par conséquent, il est largement utilisé par de nombreux chercheurs.
En comparant les différents types de systèmes d’appâts à insectes, Beauveria bassiana et Metarhizium anisopliae sont les espèces d’EPF les plus courantes que l’on trouve chez les insectes appartenant aux hémiptères, aux lépidoptères, aux blattella et aux coléoptères6,12,13,14. Parmi ces appâts d’insectes, Galleria mellonella (ordre des lépidoptères) et Tenebrio molitor (ordre des coléoptères) montrent des taux de récupération plus élevés de Beauveria et de Metarhizium spp., par rapport à d’autres insectes. Par conséquent, G. mellonella et T. molitor sont couramment utilisés pour l’appâtage des insectes. Au fil des ans, le Département de l’Agriculture des États-Unis (USDA) a créé une bibliothèque EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) qui contient une grande variété d’espèces, dont 4081 espèces de Beauveria spp., 18 espèces de Clonostachys spp., 878 espèces de Cordyceps spp., 2473 espèces de Metarhizium spp., 226 espèces de Purpureocillium spp., et 13 espèces de Pochonia spp. entre autres15. Une autre bibliothèque EPF a été construite par le Laboratoire de recherche en entomologie (ERL) de l’Université du Vermont aux États-Unis pendant environ 30 ans. Il comprend 1345 souches d’EPF en provenance des États-Unis, d’Europe, d’Asie, d’Afrique et du Moyen-Orient16.
Pour lutter contre les ravageurs locaux ou d’invasion à Taïwan, l’isolement et la sélection des FPE indigènes sont nécessaires. Par conséquent, dans ce protocole, nous avons modifié et décrit la procédure de la méthode d’appât du sol et l’avons combinée avec le système d’appât d’insecte (ver de farine, Mouebrio molitor)17. Sur la base de ce protocole, une bibliothèque EPF a été créée. Deux cycles de dépistage (quantification de l’inoculation) ont été effectués pour les isolats préliminaires de FPE. Les isolats d’EPF ont montré une pathogénicité pour les insectes. Les souches potentielles ont été soumises à des identifications morphologiques et moléculaires et analysées plus avant par le test de thermotolérance et de production conique. En outre, un concept de nombre de conidies effectives (ECN) a également été proposé. À l’aide de la formule ECN et de l’analyse en composantes principales (APC), les souches potentielles ont été analysées sous pression environnementale simulée pour compléter le processus d’établissement et de criblage de la bibliothèque EPF. Par la suite, la pathogénicité des souches prometteuses de FPE a été testée pour le ravageur cible (p. ex., Spodoptera litura). Le protocole actuel intègre les données de thermotolérance et de production conique dans la formule ECN et l’analyse PCA, qui peuvent être utilisées comme système de classement standard pour la recherche liée à l’EPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les champignons entomopathogènes (EPF) ont été utilisés pour la lutte contre les insectes. Il existe plusieurs méthodes pour isoler, sélectionner et identifier les FPE30,31,32. En comparant les différents types de méthodes d’appâts à insectes, Beauveria bassiana et Metarhizium anisopliae ont été couramment trouvés dans les appâts à insectes6,12,13,14.<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par la subvention 109-2313-B-005 -048 -MY3 du ministère de la Science et de la Technologie (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
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