यहां हम मीलवर्म (टेनेब्रियो मोलिटर) के आधार पर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं – चारा प्रणाली जिसका उपयोग मिट्टी के नमूनों से एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) को अलग करने और चुनने के लिए किया गया था। एक प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) सूत्र का उपयोग क्षेत्र में कीट माइक्रोबियल नियंत्रण के लिए शारीरिक विशेषताओं के आधार पर उच्च तनाव सहिष्णु ईपीएफ का चयन करने के लिए किया जाता है।
एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) एकीकृत कीट प्रबंधन के लिए माइक्रोबियल नियंत्रण एजेंटों में से एक हैं। स्थानीय या आक्रामक कीटों को नियंत्रित करने के लिए, स्वदेशी ईपीएफ को अलग करना और चुनना महत्वपूर्ण है। इसलिए, कीट चारा (mealworm, Tenebrio molitor) प्रणाली के साथ संयुक्त मिट्टी चारा विधि कुछ संशोधनों के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। अलग-थलग ईपीएफ को तब कृषि कीट स्पोडोप्टेरा लिटुरा के खिलाफ विषाणु परीक्षण के अधीन किया गया था। इसके अलावा, संभावित ईपीएफ उपभेदों को रूपात्मक और आणविक पहचान के अधीन किया गया था। इसके अलावा, conidia उत्पादन और thermotolerance परख होनहार ईपीएफ उपभेदों के लिए प्रदर्शन किया गया था और तुलना की; इन आंकड़ों को प्रयोगशाला रैंकिंग के लिए प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) के सूत्र में प्रतिस्थापित किया गया था। मिट्टी चारा-mealworm प्रणाली और ECN सूत्र कीट प्रजातियों को प्रतिस्थापित करने और व्यावसायीकरण और क्षेत्र अनुप्रयोग के मूल्यांकन के लिए अधिक तनाव कारकों को एकीकृत करके सुधार किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ईपीएफ चयन के लिए एक त्वरित और कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है और जैविक नियंत्रण एजेंटों पर अनुसंधान में सुधार करेगा।
वर्तमान में, एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) का व्यापक रूप से कृषि, वन और बागवानी कीटों के माइक्रोबियल नियंत्रण में उपयोग किया जाता है। ईपीएफ के फायदे इसकी विस्तृत मेजबान श्रेणियां, अच्छी पर्यावरणीय अनुकूलनशीलता, पर्यावरण के अनुकूल प्रकृति हैं, और इसका उपयोग अन्य रसायनों के साथ एकीकृत कीट प्रबंधन 1,2 के लिए सहक्रियात्मक प्रभाव दिखाने के लिए किया जा सकता है। एक कीट नियंत्रण एजेंट के रूप में आवेदन के लिए, या तो रोगग्रस्त कीड़ों या प्राकृतिक वातावरण से बड़ी संख्या में ईपीएफ को अलग करना आवश्यक है।
उनके मेजबानों से इन जीवों का नमूना प्राकृतिक मेजबान3,4,5 में ईपीएफ के भौगोलिक वितरण और प्रसार दर को समझने में मदद करता है। हालांकि, कवक संक्रमित कीड़ों का संग्रह आमतौर पर पर्यावरणीय कारकों और फील्ड 4 में कीट आबादी द्वारा सीमित होता है। यह देखते हुए कि कीट मेजबान ईपीएफ संक्रमण के बाद मर जाएंगे और फिर मिट्टी में गिर जाएंगे, मिट्टी के नमूनों से ईपीएफ का अलगाव एक स्थिर संसाधन हो सकता है3,6। उदाहरण के लिए, सैप्रोफाइट्स को विकास के लिए अपने संसाधन के रूप में मृत मेजबान का उपयोग करने के लिए जाना जाता है। मिट्टी के चारा और चयनात्मक मध्यम प्रणालियों का व्यापक रूप से उपयोग मिट्टी से ईपीएफ का पता लगाने और अलग करने के लिए किया गया है3,4,7,8,9,10।
चयनात्मक मध्यम विधि में, पतला मिट्टी के घोल को बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए व्यापक-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, क्लोरैम्फेनिकोल, टेट्रासाइक्लिन, या स्ट्रेप्टोमाइसिन) वाले माध्यम पर चढ़ाया जाता है2,3,9,11। हालांकि, यह बताया गया है कि यह विधि तनाव की विविधता और घनत्व को विकृत कर सकती है और कई माइक्रोबियल समुदायों के अधिक या कम अनुमान का कारण बन सकती है। इसके अलावा, अलग-थलग उपभेद कम रोगजनक होते हैं और अलगाव के दौरान सैप्रोफाइट्स के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। पतली मिट्टी के घोल से ईपीएफ को अलग करना मुश्किल है3। एक चयनात्मक माध्यम का उपयोग करने के बजाय, मिट्टी का चारा विधि संक्रमित मृत कीड़ों से ईपीएफ को अलग करती है, जिसे 2-3 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, जिससे अधिक कुशल और मानक ईपीएफ पृथक्करण विधि प्रदान की जा सकती है3,4,7,6। क्योंकि विधि को संचालित करना आसान है, इसलिए कोई भी कम लागत पर विभिन्न प्रकार के रोगजनक उपभेदों को अलग कर सकता है। इसलिए, यह व्यापक रूप से कई शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है।
विभिन्न प्रकार के कीट चारा प्रणालियों की तुलना करने पर, Beauveria bassiana और Metarhizium anisopliae सबसे आम ईपीएफ प्रजातियां हैं जो हेमिप्टेरा, लेपिडोप्टेरा, ब्लैटेला और कोलिओप्टेरा 6,12,13,14 से संबंधित कीड़ों में पाई जाती हैं। इन कीट चारा के बीच, गैलेरिया मेलोनेला (ऑर्डर लेपिडोप्टेरा) और टेनेब्रियो मोलिटर (ऑर्डर कोलोप्टेरा) अन्य कीड़ों की तुलना में ब्यूवेरिया और मेटारिज़ियम एसपीपी की उच्च वसूली दर दिखाते हैं। इसलिए, जी मेलोनेला और टी मोलिटर आमतौर पर कीट चारा के लिए उपयोग किए जाते हैं। इन वर्षों में, संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग (यूएसडीए) ने एक ईपीएफ लाइब्रेरी (ईपीएफ संस्कृतियों का कृषि अनुसंधान सेवा संग्रह, एआरएसईएफ) की स्थापना की है, जिसमें विभिन्न प्रकार की प्रजातियां शामिल हैं, जिसमें ब्यूवेरिया एसपीपी की 4081 प्रजातियां, क्लोनोस्टैचिस एसपीपी की 18 प्रजातियां, कॉर्डिसेप्स एसपीपी की 878 प्रजातियां, मेटारिज़ियम एसपीपी की 2473 प्रजातियां, पुरपुरियोसिलियम एसपीपी की 226 प्रजातियां शामिल हैं। और पोचोनिया एसपीपी की 13 प्रजातियां दूसरों के बीच 15। एक और ईपीएफ लाइब्रेरी का निर्माण संयुक्त राज्य अमेरिका में वर्मोंट विश्वविद्यालय से एंटोमोलॉजी रिसर्च लेबोरेटरी (ईआरएल) द्वारा 30 वर्षों के लिए किया गया था। इसमें संयुक्त राज्य अमेरिका, यूरोप, एशिया, अफ्रीका और मध्य पूर्व से ईपीएफ के 1345 उपभेद शामिल हैं।
ताइवान में स्थानीय या आक्रमण कीटों को नियंत्रित करने के लिए, स्वदेशी ईपीएफ के अलगाव और चयन की आवश्यकता होती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हमने मिट्टी के चारा विधि की प्रक्रिया को संशोधित और वर्णित किया है और इसे कीट चारा (मीलवर्म, टेनेब्रियो मोलिटर) सिस्टम 17 के साथ जोड़ा है। इस प्रोटोकॉल के आधार पर, एक ईपीएफ लाइब्रेरी स्थापित की गई थी। प्रारंभिक ईपीएफ आइसोलेट्स के लिए स्क्रीनिंग के दो दौर (टीकाकरण का परिमाणीकरण) किए गए थे। ईपीएफ आइसोलेट्स ने कीड़ों को रोगजनकता दिखाई। संभावित उपभेदों को रूपात्मक और आणविक पहचान के अधीन किया गया था और आगे थर्मोटोलरेंस और कोनिडियल उत्पादन परख द्वारा विश्लेषण किया गया था। इसके अलावा, प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) की एक अवधारणा भी प्रस्तावित की गई थी। ईसीएन सूत्र और प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करते हुए, ईपीएफ लाइब्रेरी की स्थापना और स्क्रीनिंग की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए सिम्युलेटेड पर्यावरणीय दबाव के तहत संभावित उपभेदों का विश्लेषण किया गया था। बाद में, होनहार ईपीएफ उपभेदों की रोगजनकता का लक्ष्य कीट (जैसे, स्पोडोप्टेरा लिटुरा) के लिए परीक्षण किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल ईसीएन सूत्र और पीसीए विश्लेषण में थर्मोटॉलरेंस और कोनिडियल उत्पादन डेटा को एकीकृत करता है, जिसका उपयोग ईपीएफ से संबंधित अनुसंधान के लिए एक मानक रैंकिंग प्रणाली के रूप में किया जा सकता है।
कीट नियंत्रण के लिए एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) का उपयोग किया गया है। EPF30,31,32 को अलग करने, चुनने और पहचानने के लिए कई तरीके हैं। विभिन्न प्रकार के कीट चारा विधियों की तुल…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST) से अनुदान 109-2313-B-005 -048 -MY3 द्वारा समर्थित किया गया था।
Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
-20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |