Her presenterer vi en protokoll basert på måltidsorm (Tenebrio molitor)-agnsystem som ble brukt til å isolere og velge entomopathogene sopp (EPF) fra jordprøver. En effektiv conidia nummer (ECN) formel brukes til å velge høy stress tolerant EPF basert på fysiologiske egenskaper for mikrobiell kontroll i feltet.
Entomopathogene sopp (EPF) er et av de mikrobielle kontrollmidlene for integrert skadedyrshåndtering. For å kontrollere lokale eller invasive, er det viktig å isolere og velge urfolk EPF. Derfor ble jordagnmetoden kombinert med insektet agn (mealworm, Tenebrio molitor) -systemet brukt i denne studien med noen modifikasjoner. Den isolerte EPF ble deretter utsatt for virulenstesten mot landbruksskaden Spodoptera litura. Videre ble de potensielle EPF-stammene utsatt for morfologiske og molekylære identifikasjoner. I tillegg ble conidiaproduksjonen og termototoleranseanalysen utført for de lovende EPF-stammene og sammenlignet; Disse dataene ble videre erstattet i formelen for effektivt conidia-nummer (ECN) for laboratorierangering. Jordagn-måltidsormsystemet og ECN-formelen kan forbedres ved å erstatte insektarter og integrere flere stressfaktorer for evaluering av kommersialisering og feltapplikasjon. Denne protokollen gir en rask og effektiv tilnærming for EPF-seleksjon og vil forbedre forskningen på biologiske kontrollmidler.
For tiden er entomopathogene sopp (EPF) mye brukt i mikrobiell kontroll av landbruks-, skog- og hagebruk. Fordelene med EPF er dets brede vertsområder, god miljøtilpasning, miljøvennlig natur, og at den kan brukes med andre kjemikalier for å vise den synergistiske effekten for integrert skadedyrshåndtering1,2. For applikasjonen som skadedyrsbekjempelsesmiddel er det nødvendig å isolere et stort antall EPF fra enten syke insekter eller det naturlige miljøet.
Prøvetakingen av disse organismene fra vertene bidrar til å forstå den geografiske utbredelsen og prevalensen av EPF hos naturlige verter3,4,5. Imidlertid er samlingen av soppinfiserte insekter vanligvis begrenset av miljøfaktorer og insektpopulasjoner i feltet4. Tatt i betraktning at insektverter vil dø etter EPF-infeksjon og deretter falle i jorden, kan isolering av EPF fra jordprøver være en stabil ressurs3,6. For eksempel er saprofytter kjent for å bruke den døde verten som sin ressurs for vekst. Jordagn og selektive mediumsystemer har blitt mye brukt til å oppdage og isolere EPF fra jorda3,4,7,8,9,10.
I den selektive mediummetoden er den fortynnede jordløsningen belagt på et medium som inneholder bredspektret antibiotika (f.eks. kloramfenikol, tetracyklin eller streptomycin) for å hemme veksten av bakterier2,3,9,11. Det har imidlertid blitt rapportert at denne metoden kan forvrenge stammens mangfold og tetthet og kan forårsake en over- eller underestimering av mange mikrobielle samfunn6. Videre er de isolerte stammene mindre patogene og konkurrerer med saprofytter under isolasjon. Det er vanskelig å isolere EPF fra den fortynnede jordløsningen3. I stedet for å bruke et selektivt medium, isolerer jordagnmetoden EPF fra de infiserte døde insekter, som kan lagres i 2-3 uker, og gir dermed en mer effektiv og standard EPF-separasjonsmetode3,4,7,6. Fordi metoden er enkel å betjene, kan man isolere en rekke patogene stammer til en lav pris4. Derfor er det mye brukt av mange forskere.
Ved sammenligning av de forskjellige typer insektagnsystemer er Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae de vanligste EPF-artene som finnes i insekter som tilhører Hemiptera, Lepidoptera, Blattella og Coleoptera6,12,13,14. Blant disse insekt baits, Galleria mellonella (rekkefølge Lepidoptera) og Tenebrio molitor (orden Coleoptera) viser høyere utvinning rater av Beauveria og Metarhizium spp., sammenlignet med andre insekter. Derfor brukes G. mellonella og T. molitor ofte til insekt baiting. Gjennom årene har USAs landbruksdepartement (USDA) etablert et EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection av EPF-kulturer, ARSEF) som inneholder et bredt utvalg av arter, inkludert 4081 arter av Beauveria spp., 18 arter av Clonostachys spp., 878 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., og 13 arter av Pochonia spp. blant andre15. Et annet EPF-bibliotek ble konstruert av Entomology Research Laboratory (ERL) fra University of Vermont i USA i ca. 30 år. Det inkluderer 1345 stammer av EPF fra USA, Europa, Asia, Afrika og Midtøsten16.
For å kontrollere lokale eller invasjon i Taiwan, er det nødvendig med isolasjon og valg av urfolk EPF. Derfor, i denne protokollen, har vi modifisert og beskrevet prosedyren for jordagnmetoden og kombinert den med insektet agn (mealworm, Tenebrio molitor) system17. Basert på denne protokollen ble det opprettet et EPF-bibliotek. To runder med screening (kvantifisering av inokulering) ble utført for de foreløpige EPF-isolasjonene. EPF-isolasjoner viste patogenitet til insekter. De potensielle stammene ble utsatt for morfologiske og molekylære identifikasjoner og videre analysert av termototoleranse og konidial produksjonsanalyse. Videre ble det også foreslått et konsept med effektivt conidia-nummer (ECN). Ved hjelp av ECN-formel og hovedkomponentanalyse (PCA) ble de potensielle stammene analysert under simulert miljøtrykk for å fullføre prosessen med å etablere og screene EPF-biblioteket. Deretter ble patogenisitet av lovende EPF-stammer testet for målskade (f.eks. Spodoptera litura). Den nåværende protokollen integrerer termototoleranse og konidiale produksjonsdata i ECN-formelen og PCA-analysen, som kan brukes som et standard rangeringssystem for EPF-relatert forskning.
Entomopathogene sopp (EPF) har blitt brukt til insektkontroll. Det finnes flere metoder for å isolere, velge og identifisere EPF30,31,32. Sammenligning av de forskjellige typer insekt agn metoder, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae ble ofte funnet i insekt baits6,12,13,14. …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Vitenskaps- og teknologidepartementet (MOST).
Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
-20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |