Isolering och urval av entomopathogena svampar från jordprover och utvärdering av svampvinulens mot insektsskadedjur
Summary
Här presenterar vi ett protokoll baserat på mjölmask (Tenebrio molitor)-bete systemet som användes för att isolera och välja entomopathogena svampar (EPF) från jordprover. En effektiv conidia tal (ECN) formel används för att välja hög stresstolerans EPF baserat på fysiologiska egenskaper för skadedjur mikrobiell kontroll i fältet.
Abstract
Entomopathogena svampar (EPF) är ett av de mikrobiella bekämpningsmedlen för integrerat skadedjursbekämpning. För att bekämpa lokala eller invasiva skadedjur är det viktigt att isolera och välja inhemsk EPF. Därför användes jordbetemetoden i kombination med insektsbete (mjölmask, Tenebrio molitor) i denna studie med vissa modifieringar. Den isolerade EPF utsattes sedan för virulenstestet mot jordbruksskadedjuret Spodoptera litura. Dessutom utsattes de potentiella EPF stammarna för morfologiska och molekylära identifieringar. Dessutom utfördes conidiaproduktionen och termotoleranceanalysen för de lovande EPF-stammarna och jämfördes. Dessa uppgifter ersattes ytterligare med formeln för effektivt conidianummer (ECN) för laboratorierankning. Systemet med mjölmask av markbete och ECN-formeln kan förbättras genom att ersätta insektsarter och integrera fler stressfaktorer för utvärdering av kommersialisering och fälttillämpning. Detta protokoll ger ett snabbt och effektivt tillvägagångssätt för val av EPF och kommer att förbättra forskningen om biologiska kontrollmedel.
Introduction
För närvarande används entomopathogena svampar (EPF) ofta vid mikrobiell kontroll av jordbruks-, skogs- och trädgårdsskadedjur. Fördelarna med EPF är dess breda värdsortiment, god miljöanpassningsförmåga, miljövänlig natur och att det kan användas med andra kemikalier för att visa den synergistiska effekten för integrerat växtskydd1,2. För tillämpningen som skadedjursbekämpningsmedel är det nödvändigt att isolera ett stort antal EPF från antingen sjuka insekter eller den naturliga miljön.
Provtagningen av dessa organismer från deras värdar hjälper till att förstå den geografiska fördelningen och prevalensen av EPF i naturliga värdar3,4,5. Samlingen av svampinfekterade insekter begränsas dock vanligtvis av miljöfaktorer och insektspopulationer i fältet4. Med tanke på att insektsvärdar kommer att dö efter EPF-infektion och sedan falla i jorden, kan isolering av EPF från jordprover vara en stabil resurs3,6. Saprofyter är till exempel kända för att använda den döda värden som sin resurs för tillväxt. Jordbetet och selektiva mediumsystem har använts i stor utsträckning för att upptäcka och isolera EPF från jorden3,4,7,8,9,10.
I den selektiva mediummetoden pläteras den utspädda jordlösningen på ett medium som innehåller bredspektrumantibiotika (t.ex. kloramfenicol, tetracyklin eller streptomycin) för att hämma bakterietillväxten2,3,9,11. Det har dock rapporterats att denna metod kan snedvrida stammens mångfald och densitet och kan orsaka en över- eller underskattning av många mikrobiella samhällen6. Dessutom är de isolerade stammarna mindre patogena och konkurrerar med saprofyter under isolering. Det är svårt att isolera EPF från den utspädda jordlösningen3. I stället för att använda ett selektivt medium isolerar markbetesmetoden EPF från de infekterade döda insekterna, som kan lagras i 2-3 veckor, vilket ger en effektivare och standard EPF-separationsmetod3,4,7,6. Eftersom metoden är lätt att använda kan man isolera en mängd olika patogena stammar till en låg kostnad4. Därför används det ofta av många forskare.
När Beauveria bassiana och Metarhizium anisopliae jämför de olika typerna av insektsbetesystem är de vanligaste EPF-arterna som finns i insekter som tillhör Hemiptera, Lepidoptera, Blattella och Coleoptera6,12,13,14. Bland dessa insektsbeten visar Galleria mellonella (ordning Lepidoptera) och Tenebrio molitor (ordning Coleoptera) högre återhämtningshastigheter för Beauveria och Metarhizium spp., jämfört med andra insekter. Därför används G. mellonella och T. molitor ofta för insektsbete. Under årens lopp har USA: s jordbruksdepartement (USDA) etablerat ett EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) som innehåller en mängd olika arter, inklusive 4081 arter av Beauveria spp., 18 arter av Clonostachys spp., 878 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 2473 arter av Metarhiz och 13 arter av Pochonia spp. bland andra15. Ett annat EPF-bibliotek byggdes av Entomology Research Laboratory (ERL) från University of Vermont i USA i omkring 30 år. Den omfattar 1345 stammar av EPF från USA, Europa, Asien, Afrika och Mellanöstern16.
För att bekämpa lokala skadedjur eller invasionsskadedjur i Taiwan krävs isolering och urval av inhemsk EPF. Därför har vi i detta protokoll modifierat och beskrivit förfarandet för jordbetemetoden och kombinerat det med insektsbete (mjölmask, Tenebrio molitor) system17. Baserat på detta protokoll inrättades ett EPF-bibliotek. Två screeningrundor (kvantifiering av inokulering) utfördes för de preliminära EPF-isolaten. EPF isolat visade patogenicitet till insekter. De potentiella stammarna utsattes för morfologiska och molekylära identifieringar och vidare analyseras av thermotolerance och conidial produktion analys. Vidare föreslogs också ett koncept med effektivt conidianummer. Med hjälp av ECN-formeln och huvudkomponentanalysen (PCA) analyserades de potentiella stammarna under simulerat miljötryck för att slutföra processen för att upprätta och granska EPF-biblioteket. Därefter testades patogenicitet av lovande EPF-stammar för målskadedjuret (t.ex. Spodoptera litura). Det nuvarande protokollet integrerar termotolerans- och konidiella produktionsdata i ECN-formeln och PCA-analysen, som kan användas som ett standardrankningssystem för EPF-relaterad forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entomopathogenic svampar (EPF) har använts för insektskontroll. Det finns flera metoder för att isolera, välja och identifiera EPF30,31,32. Genom att jämföra de olika typerna av insektsbetesmetoder hittades Beauveria bassiana och Metarhizium anisopliae ofta i insektsbeten6,12,13,14.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
