Summary
Fettsyre β-oksidasjon er en viktig metabolsk vei som er ansvarlig for å generere energi i mange forskjellige celletyper, inkludert hepatocytter. Her beskriver vi en metode for å måle fettsyre β-oksidasjon i nyisolerte primære hepatocytter ved hjelp av 14C-merket palmittsyre.
Abstract
Fettsyre β-oksidasjon er en viktig metabolsk vei for å møte leverens energibehov og gi substrater og kofaktorer for flere prosesser, for eksempel ketogenese og glukoneogenese, som er avgjørende for å opprettholde helkropps glukose homeostase og støtte ekstra-leverorganfunksjon i fastet tilstand. Fettsyre β-oksidasjon skjer innenfor mitokondriene og peroksisomene og reguleres gjennom flere mekanismer, inkludert opptak og aktivering av fettsyrer, enzymuttrykksnivåer og tilgjengelighet av kofaktorer som koenzym A og NAD +. I analyser som måler fettsyre β-oksidasjon i lever homogenater, celle lysis og den vanlige tilsetningen av suprafysiologiske nivåer av kofaktorer maskere effekten av disse regulatoriske mekanismene. Videre er organellenes integritet i homogenatene vanskelig å kontrollere og kan variere betydelig mellom preparater. Målingen av fettsyre β-oksidasjon i intakte primære hepatocytter overvinner de ovennevnte fallgruvene. Denne protokollen beskriver en metode for måling av fettsyre β-oksidasjon i en suspensjon av nyisolerte primærmushedocytter inkubert med 14C-merket palmesyre. Ved å unngå timer til dager med kultur, har denne metoden fordelen av bedre å bevare proteinuttrykksnivåene og metabolske baneaktiviteten til den opprinnelige leveren, inkludert aktivering av fettsyre β-oksidasjon observert i hepatocytter isolert fra faste mus sammenlignet med matede mus.
Introduction
Fettsyre β-oksidasjon er en viktig prosess i lipidmetabolismen, og gir en katabolsk vei for å balansere fettsyresyntese og inntak fra dietten. Denne prosessen genererer energi for flere organer, inkludert hjertemuskelen, nyrebarken og fastet lever, og bruker fettsyrer hentet fra dietten, fettvev lipolyse og intern triglyserid lagrer 1,2.
Oksidasjon av fettsyre gjennom β-oksidasjonsveien resulterer i sekvensiell forkortelse av fettakylkjeden med to karboner om gangen, utgitt som acetyl-CoA, og denne prosessen skjer både i mitokondriene og peroksisomene. Mens de fleste fettsyrer bare gjennomgår β oksidasjon, oksideres noen ved forskjellige karboner før de kommer inn i denne banen. For eksempel gjennomgår 3-metyl-erstattede fettsyrer, som fytansyre, fjerning av ett karbon ved α-oksidasjon i peroksisomene før de går inn i β-oksidasjonsveien. På samme måte omdannes noen fettsyrer først til dikarboksylfettsyrer ved oksidasjon av terminal metylgruppen (ω-oksidasjon) i endoplasmatisk retikulum før de foretrekkes oksidert i peroksisomene vedβ-oksidasjon 3.
Uavhengig av den spesifikke organellen må en fettsyre først omdannes til et koenzym A (CoA) thioester, eller acyl-CoA, som skal oksideres gjennom β-oksidasjonsveien. β-oksidasjon av langkjedede acyl-coAs i mitokondriematrisen krever karnitinfergen for translokasjon, hvor karnitin palmitoyltransferase 1 (CPT1) katalyserer konverteringen av acyl-coAs til acylcarnitiner og er det hastighetsbegrensende enzymet i denne prosessen4. Når de er omplassert til mitokondriematrisen, blir acyl-coAs re-dannet og tjener som substrater for mitokondrie β-oksidasjonsmaskineri. I fastende tilstand kanaliseres acetyl-CoA produsert gjennom β-oksidasjon i hepatisk mitokondrier primært til ketogenese. Peroksisomer tjener som det primære stedet for β-oksidasjon av svært langkjedede, forgrenede kjede- og dikarboksylfettsyrer. Peroksisomer krever ikke karnitintransport for å importere fettsyresubstrater, i stedet importere korrespondent acyl-coAs gjennom aktiviteten til ATP-bindende kassett (ABC) transportører ABCD1-35. Innenfor peroksisomene oksideres acyl-coAs deretter av et dedikert sett med enzymer, forskjellig fra mitokondriefettsyren β-oksidasjonsmaskineri. Både mitokondrier og peroksisomer krever også tilførsel av NAD+ og gratis CoA for å oksidere fettakylkjeder. CoA nivåer i leveren har vist seg å øke som svar på faste, støtte den økte hastigheten på fettsyre oksidasjon som oppstår i denne tilstanden6. Videre resulterer økt CoA-nedbrytning i peroksisomene i en selektiv reduksjon i peroksimal fettsyreoksidasjon7. Derfor er prosessen med fettsyreoksidasjon i cellen regulert av uttrykksnivåene og aktivitetene til enzymer som er involvert i aktivering, transport og oksidasjon av fettsyrer, samt konsentrasjonen av kofaktorer og andre metabolitter gjennom flere subcellulære rom.
Prosedyrer som bruker vev homogenater for å måle fettsyreoksidasjon ødelegger den cellulære arkitekturen som regulerer og støtter denne prosessen, noe som fører til en samling data som ikke nøyaktig gjenspeiler in vivometabolismen. Mens teknikker som bruker belagte primære hepatocytter bevarer dette systemet, fører dyrking av isolerte celler i lengre perioder til tap av in vivo-genuttrykksprofilen som var tilstede i cellene da de fortsatt bodde i dyret 8,9. Følgende protokoll beskriver en metode for å isolere primære hepatocytter og analyse deres kapasitet for fettsyre β-oksidasjon umiddelbart etter isolasjon og suspensjon, ved hjelp av [1-14C]palmittsyre. Analysen er basert på måling av radioaktiviteten forbundet med de syreløselige metabolittene (ASM) eller produktene, som acetyl-CoA, produsert ved β-oksidasjon av [1-14C]palmitinsyre10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer på mus (C57BL/6J, menn, 9-11 ukers alder) ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved West Virginia University.
1. Hepatocytisolasjon
- Forberedelse
- I dagene før hepatocytisolasjonen forbereder du bufferne og cellekulturmediene som er oppført i tabell 1. Sett opp et vannbad med temperaturen satt til 37 °C i nærheten av der operasjonen skal utføres.
- På dagen for hepatocytisolasjonen, under en laminær strømningshette, overfør 35 ml buffer 1 til et sterilt 50 ml sentrifugerør og 70 ml buffer 2 til et 100 ml sterilt beger eller flaske.
- Tilsett antibiotika gentamicin (50 μg/ml) og penicillin/streptomycin (1x) i begge bufferne.
- Overfør 20 ml Buffer 2 som klargjort i trinn 1.1.3 til en 100 mm cellekulturrett og legg på is.
- Overfør de resterende 50 ml buffer 2 til et sterilt sentrifugerør på 50 ml. Plasser de 50 ml rørene som inneholder de antibiotika-supplerte bufferne 1 og 2 i et vannbad satt til 37 °C og la dem varme opp i minst 15 minutter før du starter perfusjonen.
MERK: Hvis du utfører flere hepatocytter isolasjoner i en økt, skalere opp antall antibiotika-supplert aliquots av buffere 1 og 2 for å forberede tilsvarende. - Tine en aliquot av kollagenase løsning og holde på is.
MERK: Hvis det lagres riktig, er det ikke noe betydelig tap av enzymaktivitet i kollagenaseløsninger frosset og tint opptil 3 ganger og brukt innen 3 uker etter tilberedning. - Forbered kirurgiske instrumenter og peristaltisk pumpe. Steriliser linjene til den peristaltiske pumpen ved å sirkulere 15 ml 70% etanol, etterfulgt av 15 ml sterilt vann.
- Koble en 22 G nål til utgangslinjen (figur 1A). Det hule filteret til et kateter fungerer godt som en kontakt. Fyll linjene med Buffer 1 og kontroller linjene, kontakten og nålen for å sikre at ingen luftbobler er fanget.
Figur 1: Perfusjonsapparat og perfundert lever. (A) Peristaltisk pumpe med utløpsledning koblet til nålen som brukes til å kanylere og parfyme leveren. (B) Vellykket kannasjon er indikert ved umiddelbar og homogen blanchering av leveren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Leverperfusjon og dissosiasjon
- Bedøv en mus via isofluraninnånding med medisinsk luft som bærergass, ved hjelp av 4% isofluran for induksjon og 1,5% isofluran for å opprettholde anestesi. Kontroller dybden av anestesi ved å vurdere tap av pedalrefleks.
- Når det ikke er respons på tåklemming, plasser musen i en liggende stilling på et operasjonsbrett, outstretch lemmer, og fest dem til brettet med pinner.
- Spray magen og brystet på musen liberalt med 70% etanol.
- Bruk tang, trekk opp huden og bukveggen nær bunnen av magen og kutt lateralt, på hver side av midtlinjen og opp til membranen, for å eksponere organene.
- Utsett den dårligere vena cava (IVC) ved å flytte tarmene til høyre side og forsiktig snu leverens lober opp. Sett inn et lite sylindrisk objekt, for eksempel en nålehette, under baksiden av musen for å vippe IVC litt og lette kanyleringen (figur 1B).
- Start pumpen med laveste hastighet, og sett nålen inn i IVC med buffer 1.
- Klipp portalvenen for å lindre trykket og tillate drenering av blod- og perfusjonsbuffere, og øk deretter strømningshastigheten umiddelbart til 7 ml / min. Hvis det gjøres riktig, vil leveren jevnt blanchere i løpet av få sekunder (figur 1B).
- For mer konsistente resultater, hold nålen på plass for hånd i hele varigheten av perfusjonen.
- Perfuse leveren med varm Buffer 1. For å unngå å introdusere luftbobler, må du sørge for at linjen som er satt inn i røret som inneholder Buffer 1, forblir kontinuerlig nedsenket.
- Mens perfusjon oppstår, tilsett 130 μL kollagenoppløsning til Buffer 2 og bland ved å pipettere opp og ned eller røre med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipette.
- Når volumet i røret som inneholder Buffer 1 reduseres til ca. 5 ml, tilsetter du sakte 5 ml buffer 2 til buffer 1 ved å pipettere på siden av røret. Målet er å unngå å introdusere luftbobler i linjen mens du bytter fra buffer 1 til buffer 2.
- Vent til volumet reduseres igjen til 5 ml og tilsett langsomt ytterligere 5 ml buffer 2. Gjenta en gang til. Når Buffer 2 erstatter Buffer 1 og dissosiasjonen starter, vil leveren svulme.
- Legg den gjenværende bufferen 2 til røret som opprinnelig inneholdt Buffer 1. Stopp perfusjonen når det er ca. 5-10 ml buffer 2 igjen i røret.
MERK: Mens Buffer 2 parfymerer leveren, kan portalvenen periodisk klemmes med tang i 5 s. Dette trinnet er valgfritt, men den resulterende økningen i trykket gjennom hele leveren kan forbedre sin dissosiasjon og dermed det endelige hepatocyttutbyttet. - Sluk leveren forsiktig og overfør den til 100 mm kulturfatet som inneholder 20 ml iskald buffer 2 satt til side i trinn 1.1.4.
- Under laminær strømningshette bryter du leveren forsiktig fra hverandre ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett.
- Tilsett ca 20 ml iskald M199 i hepatocyttfjæringen og filtrer den gjennom en 100 μm cellesil ved hjelp av stempelet på en sprøyte for forsiktig å fremme frigjøring av ekstra hepatocytter fra større leverstykker.
- Vask 100 mm kulturfatet og cellesilen med ekstra M199 til oppsamlingsrøret er fullt.
- Sentrifuger suspensjonen ved 50 x g i 2 min ved 4 °C. Aspirer forsiktig den supernatante og forsiktig resuspend hepatocyttpellet i 30 ml kaldt M199 ved å virvle.
- Pellet hepatocyttene som nevnt i trinn 1.2.18. Gjenta vasken en gang til.
- Resuspend hepatocyttene i 10 ml varm M199 og bestem levedyktigheten og utbyttet ved hjelp av trypanblå eksklusjonsmetode og et hemocytometer12.
- Fortynn cellene i M199 varmet til 37 ºC til en endelig konsentrasjon på 1,0 x 106 levedyktige celler / ml og start umiddelbart analysen.
2. Fettsyre β-oksidasjonsanalyse
MERK: Analysen utføres i triplikat, og hver reaksjonsblanding inneholder 750 000 celler, 1,35 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 100 μM palmitinsyre og 0,4 μCi [1-14C]palmitasjonssyre i et endelig volum på 2 ml.
FORSIKTIG: Radioaktive forbindelser er farlige. Kjøp, håndter, lagre og kast radioaktivt materiale i samsvar med institusjonelle, statlige og føderale forskrifter.
- Forberedelse
- I dagene før analysen forbereder du palmesyren og BSA-løsningene (tabell 1) og lagrer dem ved -20 °C.
- På analysedagen fullfører du trinn 2.1.3-2.1.9 før du starter leverens perfusjon.
- Tine palmesyren og BSA-løsningene. Forbered substratblandingen for flere reaksjoner pluss et overskudd på 20%-30%, med et typisk analyseoppsett vist i tabell 2.
- Aliquot 13,5 μL BSA-oppløsning per reaksjon i et mikrocentrifugerør og varm til 41 °C, tilsett deretter 1 μL av den 200 mM palmistiske syreoppløsningen (BSA: palmittsyremolarforhold = 1:5) per reaksjon.
MERK: Det er å foretrekke å dispensere løsninger fremstilt ved hjelp av organiske løsningsmidler, slik som radioaktive og ikke-radioaktive palmesyreløsninger, med en positiv forskyvningspipette og passende tips. - Virvel kraftig og inkuberer ved 41 °C for å lette dannelsen av den oppløselige palmisittsyren: BSA-komplekset. Virvel av og til i inkubasjonsperioden.
- Blandingen vil i utgangspunktet virke overskyet, men vil avklare helt etter 20-30 min inkubasjon ved 41 °C. Hold den ved 41 °C til den er klar til å starte reaksjonene.
- Aliquot 133 μL 1 M perklorsyre i 1,5 ml mikrosenterrør for å stoppe reaksjonene.
FORSIKTIG: Perklorsyre er en sterk syre og et sterkt oksidant. Passende beskyttelsesutstyr er nødvendig for å håndtere denne forbindelsen. - Aliquot 485,5 μL M199 per reaksjon i et rør og hold det ved 37 °C for å fortynne det radioaktive BSA: palmesyrekompleks fremstilt ved trinn 2.1.4-2.1.6 før reaksjonene startes.
- Dispenser 750 μL M199 i så mange 14 ml rundbunnsrør som prøvene. Tilsett eventuelt hemmere av fettsyre β oksidasjon, som etomoksir, rotenon og antimycin, inkludert en kjøretøykontroll (tabell 2).
- Under hepatocytvasktrinnene, 10-15 min før du starter reaksjonene, overfør rørene som er tilberedt i trinn 2.1.9 til et ristende vannbad satt til 37 °C og rist ved 180-200 o/min.
- Starte, stoppe og analysere fettsyren β-oksidasjonsreaksjoner
- Hvis hepatocyttenes levedyktighet er akseptabel (vanligvis ≥ 75%, figur 2), for hver reaksjon, overfør 0,8 μL [1-14 C]palmitinsyre (0,5 mCi/ml) til mikrocentrifugerøret som inneholder den klargjorte BSA: palmitinsyreoppløsning (trinn 2.1.4-2.1.6). Virvel og gå tilbake til vannbadet ved 41 °C.
- For å likevekte hepatocyttene til 37 °C og for å inkubere dem med hemmere (hvis de finnes), umiddelbart etter den endelige hepatocyttrepensjonen (trinn 1.2.21), overfør 750 μL hepatocyttfjæringen med en 1 ml pipette til hvert av de 14 ml rundbunnsrørene i ristingsvannbadet (trinn 2.1.9-2.1.10) og virvel kort ved lav hastighet for å blande.
- Forskyv hvert tillegg med 30 s og inkuber i 15 min. For å lagre en prøve for proteinbestemmelse, overfør en annen aliquot av hepatocytter til et 1,5 ml mikrosenterrør og spinn på 3000 x g i 5 minutter.
MERK: Under utlevering må hepatocyttfjæringen kontinuerlig virvles eller forsiktig omrøres med dispensering av 1 ml pipette for å forhindre sedimentering og stor variasjon i cellenummer på tvers av prøver. - Fjern supernatanten og oppbevar pelletsen ved -80 °C til den er klar til å måle den totale mengden protein i prøven for å normalisere resultatene (figur 3).
- Mens hepatocyttene er under pre-inkubasjon ved 37 °C, tilsett radioaktivt BSA: palmesyrekompleks til det varme mediet i 2,1,8, og hold ved 37 °C til du er klar til å starte reaksjonene. Dette er den siste substratblandingen.
- For å starte reaksjonene, fjern hepatocyttene fra vannbadet og tilsett 500 μL substratblanding.
- Vortex ved lav hastighet i 5 s for å fullstendig resuspendere cellene og gå tilbake til vannbadet. Gjenta med alle prøvene, svimlende med 30 s.
- Inkuber i 15 min. Start et sett med reaksjoner og stopp umiddelbart (se trinn 2.2.10-2.2.11) for å fastslå bakgrunnsradioaktiviteten (tabell 2).
- Overfør dupliserte aliquots (200-250 μL) av resterende substratblanding til 6 ml scintillasjonshylser og sett til side for å telle. Bruk disse tallene til å beregne radioaktiviteten som tilsvarer de totale nmolene av palmittsyre som er tilgjengelige for oksidasjon i 500 μL substratblanding.
- For å stoppe reaksjonene, fjern hepatocyttene fra vannbadet, resuspend hepatocyttene ved virveling ved moderat hastighet, og overfør deretter 400 μL av hepatocyttfjæringen til mikrocentrifugerørene som inneholder perklorsyre.
- Kapp straks rørene. Gjenta denne sekvensen for alle prøvene, svimlende med 30 s.
- Virvel kraftig de 1,5 ml mikrocentrifugerørene og spinn dem ned de 1,5 ml mikrocentrifugerørene på 13 000 x g i 10 minutter.
- Overfør 300 μL av supernatanten til et 6 ml scintillasjonshette hetteglass, tilsett 4 ml scintillasjonsvæske, og tell radioaktiviteten i prøvene og substratblandingen aliquots (trinn 2.2.9) i en scintillasjonsteller.
FORSIKTIG: Etter sentrifugering åpner du rørene under en avtrekkshette for å unngå å puste inn 14C-CO2 produsert ved fullstendig oksidasjon av 14C-acetyl-CoA generert av fettsyre β-oksidasjon og frigjøres av de sure forholdene.
| Buffere/mediekomponenter | Beløp | Endelig konsentrasjon | Instruks |
| Løsning C | |||
| KCl | 1,79 g | 480 mM | Tilsett vann til 50 ml. Oppbevars ved 4 °C |
| MgSO4 heptahydrat | 1,48 g | 120 mM | |
| KH2Po4 | 0,81 g | 119 mM | |
| Krebs-Henseleit Buffer (KHB), kalsiumfri | |||
| NaCl | 7,0 g | 120 mM | Tilsett vann til 900 ml, juster pH til 7,4, og ta det endelige volumet til 1 L. Oppbevar den ved 4 °C |
| NaHCO3 | 2,0 g | 24 mM | |
| 1 M HEPES pH 7,45 | 5 ml | 5 mM | |
| Glukose | 1 eller 2 g | 5,6 eller 11 mM | |
| Løsning C | 10 ml | ||
| Buffer 1 | |||
| KHB | 500 ml | Bland komponenter og filtrer steriliser. Oppbevars ved 4 °C | |
| 50 mM EGTA | 1,0 ml | 0,1 mM | |
| Buffer 2 | |||
| KHB | 500 ml | Bland komponenter og filtrer steriliser. Oppbevars ved 4 °C | |
| 1 M CaCl2 dihydrat | 686 μL | 1,4 mM | |
| Gentamicin løsning | |||
| Gentamicinsulfat | 0,5 g | 50 mg/ml | Tilsett vann til 10 ml og filtrer steriliser. Aliquot og oppbevar ved -20 °C |
| Collagenase-løsning | |||
| Collagenase I og II blanding | 10 mg | 7 mg/ml | Løs opp hele innholdet av hetteglasset i 1,43 ml vann. Aliquot og oppbevar ved -20 °C |
| M199 | |||
| M199 | 1 pose | Tilsett vann til 900 ml og juster pH til 7,2-7,4. Ta det endelige volumet til 1 L og filtrer steriliser. Oppbevars ved 4 °C | |
| NaHCO3 | 2,2 g | 26 mM | |
| 1 M HEPES (cellekultur klasse) | 25 ml | 25 mM | |
| Ekstra glukose (kun for matede mus) | 1 g | 11 mM | |
| BSA-løsning | |||
| Fettsyrefri BSA | 400 mg | 20 % (m/v) | Løs opp i 2 ml vann. Aliquot og oppbevar ved -20 °C |
| Ikke-radioaktiv palmesyreoppløsning | |||
| Palmitisk syre | 103 mg | 200 mM | Oppløsning i 2 ml etanol, oppbevar ved -20 °C |
| 1 M perklorsyre | |||
| 70% perklorsyre | 3,5 ml | 1 M | Fortynn til 40 ml med vann. Oppbevars ved romtemperatur |
Tabell 1: Buffere, medier og andre løsninger som kreves for hepatocytisolasjonen og fettsyren β-oksidasjonsanalyse
| Reaksjonsnummer | M199 ± Hemmere | Hepatocytt suspensjon (μL) | Substratblanding (μL) | ||||
| Volum (μL) | Etomoxir | ||||||
| 1 | 750 | - | Forvarm ved 37 °C | 750 | Pre-inkubering ved 37 °C i 15 min | 500 | Inkuber ved 37 °C i 15 min |
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | + | ||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | + | Stopp umiddelbart | |||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
Tabell 2: Eksempel på det eksperimentelle oppsettet for en hepatocyttfjæring analysert i triplikat i nærvær og fravær av etomoksir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leverperfusjonen som er beskrevet her, gir vanligvis 30-40 millioner celler/lever med gjennomsnittlig levedyktighet på 80 %, som estimert ved trypanblå ekskludering (figur 2). Den typiske konsentrasjonen av glukose i Krebs-Henseleit-bufferen (KHB), som brukes til å forberede perfusjonsbufferne 1 og 2, er 11 mM. Ved måling av fettsyre β-oksidasjon i hepatocytter isolert fra faste mus, kan konsentrasjonen av glukose i KHB senkes for bedre å representere fastende tilstand. Som vist i figur 2 har senking av glukosekonsentrasjonen til 5,6 mM ingen negativ effekt på hepatocyttenes utbytte eller levedyktighet.
Tabell 2 viser et typisk eksperimentelt oppsett for en hepatocyttfjæring analysert i triplikat i nærvær og fravær av etomoksir, en potent hemmer av CPT1 og dermed mitokondriefettsyreoksidasjon10,13. I nærvær av denne eller andre hemmere av mitokondriefettsyreoksidasjon, kan eventuelle gjenværende 14C-merkede produkter generert av [1-14C]palmitinsyreoksidasjon tilskrives den første syklusen av β-oksidasjon i peroksisomene. Dermed kan bidraget av mitokondriefettsyreoksidasjon til total fettsyre β-oksidasjon beregnes som forskjellen mellom total (-etomoksir) og peroksisomal (+ etomoksir) fettsyreoksidasjon 7,14,15 (figur 3).
For hepatocytter finnes mer enn 95% av radioaktiviteten forbundet med produktene fra β-oksidasjon av [1-14C]palmittsyre i ASM, og resten frigjøres som 14C-CO210. Antallene per minutt (CPM) som er forbundet med bakgrunnsradioaktiviteten, varierer med batchen av [1-14C]palmistisk syre. Imidlertid er de fortsatt betydelig lavere enn CPM oppnådd i prøver som er tillatt å inkubere med substratblandingen i 15 min (figur 3A). Som forventet viser hepatocytter isolert fra faste mus en robust økning i frekvensen av både mitokondrie og peroksisomal fettsyre β-oksidasjon, i samsvar med den kjente aktiveringen av disse veiene 16,17,18,19.
Figur 2: Levedyktighet og utbytte av hepatocytter isolert ved hjelp av prosedyren som er beskrevet her. Hepatocytter ble isolert fra mannlige mus matet ad libitum eller fastet over natten i 16-18 timer, med fri tilgang til vann. (A) Hepatocytt levedyktighet og (B) utbytte per lever. Data rapporteres som gjennomsnittet (barer) av målinger på individuelle hepatocytpreparater (sirkler) ± SEM. Hepatocytter isolert fra matet og fastet mus ble sammenlignet med en uparret to-tailed Student t-test. * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fettsyre β-oksidasjonskapasitet i hepatocytter isolert fra matet og fastet hannmus og analysert i suspensjon. Nyisolerte hepatocytter ble forhåndsinkubert med etomoksir (45 μM, +Eto) eller DMSO (kjøretøy, -Eto) før tilsetning av substratblandingen. (A) Total CPM introdusert i hver analyse og gjenvunnet i ASM brøkdel av reaksjoner satt opp for å estimere bakgrunnen radioaktivitet, total (-Eto), peroxisomal (+Eto) og mitokondrie fettsyre β-oksidasjon. Disse dataene vises før korrigering (for bakgrunns-, cellenummer- eller proteinnivåer) eller andre beregninger ble brukt. (B) Data i (A) korrigert for bakgrunnen, det totale volumet av analysen, normalisert til 1 million levedyktige celler og uttrykt som hastigheten som palmittsyre oksideres i hepatocytter isolert fra matet og fastet mus. (C) Totalt protein tilsvarende anslagsvis 750 000 hepatocytter/analyse som brukes. (D) Data i (A) korrigert som i (B), men normalisert til mg protein. Data rapporteres som gjennomsnittet (barer) av målinger på individuelle hepatocytpreparater (sirkler) ± SEM. Hepatocytter isolert fra matet og fastet mus ble sammenlignet med en uparret to-tailed Student t-test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under leverens perfusjon er det viktig å unngå innføring av luftbobler, da de blokkerer mikrokapillærene i leveren, forhindrer eller begrenser buffersirkulasjonen og generelt reduserer hepatocyttutbyttet og levedyktigheten20,21. Forholdsregler, for eksempel nøye inspeksjon av den bufferfylte innløpslinjen før kanylering av IVC og unngå å løfte innløpslinjen av røret som inneholder Buffer 1 for å bytte til Buffer 2, som beskrevet heri, kan med hell redusere antall mislykkede perfusjoner (levedyktighet <70%). Bruk av boblefeller i perfusjonssystemet kan også redusere denne risikoen betydelig20,21.
Kollagenaktiviteten er en annen kritisk parameter for isolering av hepatocytter, som historisk krever testing og optimalisering av hver nye batch som er anskaffet12,20. Bruken av en svært renset og definert blanding av collagenases reduserer batch-til-batch-variasjonen dramatisk, noe som eliminerer behovet for å teste hver nye batch. Videre, når disse blandingene brukes, er små justeringer i volumet som brukes (±10-20 μL) vanligvis tilstrekkelig til å gjenopprette høye utbytter eller levedyktighet av hepatocytpreparatene.
Hepatocytter er delikate celler. Alle resuspensasjons- og dispenseringstrinn bør gjøres forsiktig ved å virvle eller pipetter sakte for å redusere skjærskader og lysis. Bruk av brede spisser kan også ytterligere minimere hepatocyttskader. Vortexing på trinn 2.2.2 og 2.2.7 av analysen bør gjøres på lavest mulig innstilling som fortsatt sikrer god blanding av komponentene.
Sammenlignet med tradisjonelle protokoller 20,21,22, er en av de store endringene som er introdusert i hepatocytisolasjonsprosedyren beskrevet her, utskifting av den intravenøse kateterinnsettingen og ligasjonen med innsetting av en hypodermisk nål holdt i posisjon av operatøren. Denne modifikasjonen gir to hovedfordeler. For det første reduserer det risikoen for å introdusere luftbobler når du kobler enden av det intravenøse kateteret til linjen, da bufferen allerede strømmer når den hypodermiske nålen settes inn i IVC. For det andre reduserer det risikoen for å perforere IVC under manipulasjoner av kateteret, for eksempel tilbaketrekking av nålen eller sikring med suturer. En av ulempene ved denne modifikasjonen er at det vanligvis er nødvendig å holde nålen på plass for hånd i varigheten av perfusjonen for å sikre konsekvent suksess av prosedyren. Dette kan være slitsomt for personen som utfører operasjonen og kan begrense antall påfølgende perfusjoner som kan gjøres i en økt. For å begrense bevegelsene til personen som holder nålen, noe som kan føre til utilsiktet perforering av IVC, anbefales det å jobbe parvis, med en person som utfører operasjonen og en annen person som endrer perfusjonsbufferne uten avbrudd i perfusjonen. Flere back-to-back perfusjoner ville kreve en tredje person å starte fettsyren β-oksidasjonsanalyse innen 1-2 min av hver fullført hepatocytisolasjon.
I likhet med andre hepatocytisolasjonsmetoder, gir prosedyren beskrevet her hepatocytter som kan brukes i suspensjon eller i kultur for å vurdere en rekke andre leverprosesser, inkludert ytterligere metabolske veier og endringer i genuttrykk på grunn av ulike behandlinger 23,24,25. For å dyrke hepatocyttene kan trinn 1.2.20-1.2.21 enkelt endres ved å resuspendere cellene i riktig medium, etterfulgt av plating i cellekulturretter og inkubasjon 20,22,26. Videre, selv om det ikke er nødvendig for β-oksidasjonsanalyse, om nødvendig av andre applikasjoner, kan prosentandelen levedyktige hepatocytter økes ved å fjerne de døde cellene gjennom et Percoll-lag 22,26.
Til slutt beskriver denne protokollen en robust analyse for å måle frekvensen av fettsyre β-oksidasjon i intakte hepatocytter og uten tilsetning av eksogene kofaktorer, og dermed bevare de endogene regulatoriske mekanismene i denne banen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM119528 til Roberta Leonardi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E.
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
