Her præsenterer vi fabrikationsprotokollen for en organisk charge-moduleret felteffekttransistor (OCMFET)-baseret enhed til in vitro cellulær interfacing. Enheden, kaldet en mikro OCMFET array, er en fleksibel, billig, og reference-mindre enhed, som vil gøre det muligt at overvåge de elektriske og metaboliske aktiviteter af elektroaktive cellekulturer.
Moderne elektrofysiologi er konstant blevet næret af den parallelle udvikling af stadig mere sofistikerede værktøjer og materialer. Til gengæld har opdagelser på dette område drevet teknologiske fremskridt i en frem og tilbage proces, der i sidste ende bestemmes de imponerende resultater i de sidste 50 år. De mest anvendte anordninger, der anvendes til cellulær interfacing (nemlig mikroelektrodesystemerne og mikroelektroniske anordninger baseret på transistorer), frembyder dog stadig flere begrænsninger såsom høje omkostninger, materialernes stivhed og tilstedeværelsen af en ekstern referenceelektrode. For delvis at løse disse problemer har der været udviklinger inden for et nyt videnskabeligt område kaldet organisk bioelektronik, hvilket har resulteret i fordele som lavere omkostninger, mere bekvemme materialer og innovative fabrikationsteknikker.
Flere interessante nye organiske enheder er blevet foreslået i løbet af det seneste årti til bekvemt interface med cellekulturer. Dette papir præsenterer protokollen for fremstilling af enheder til cellulær interfacing baseret på den organiske charge-moduleret felt-effekt transistor (OCMFET). Disse enheder, kaldet mikro OCMFET arrays (MOAs), kombinerer fordelene ved organisk elektronik og de særlige træk ved OCMFET for at forberede gennemsigtige, fleksible og referenceløse værktøjer, hvormed det er muligt at overvåge både de elektriske og metaboliske aktiviteter af kardiomyocytter og neuroner in vitro, hvilket giver mulighed for en multiparametrisk evaluering af elektrogene cellemodeller.
In vivo overvågning af elektroaktive celler, såsom neuroner og kardiomyocytter, repræsenterer en gyldig og kraftfuld tilgang i grundforskning applikationer til den menneskelige hjerne, funktionelle forbindelsesundersøgelser, farmakologi, og toksikologi. De værktøjer, der normalt anvendes til sådanne undersøgelser, er hovedsagelig baseret på mikroelektrodesystemer (MEAs)1,2,3,4,5 og stadig mere effektive og kraftfulde felteffektenheder (FED’er)6,7,8,9,10,11,12 . Disse to familier af enheder tillader realtid overvågning og stimulering af den elektriske aktivitet af neuroner og kardiomyocytter og er normalt karakteriseret ved robusthed, brugervenlighed og pålidelighed. Disse funktioner gør MEAs og FEDs guldstandarden for elektrofysiologiske applikationer, der i øjeblikket anvendes til at kommunikere med standard cellulære kulturer, organotypic hjerne skiver, og tridimensionale organoider13,14,15,16. På trods af deres udbredte brug og deres imponerende funktioner, frihandelsaftaler og LYSD’er præsentere nogle begrænsninger såsom høje omkostninger, stivhed af materialerne, og tilstedeværelsen af en normalt voluminøse reference elektrode, som skal placeres i måling flydende miljø og er nødvendig for korrekt drift af enhederne.
For at udforske alternative løsninger til cellulær interfacing er der i det seneste årti blevet investeret en stor indsats i studiet af elektroniske enheder baseret på organiske materialer og innovative fremstillingsteknikker17. Blandt de flere organiske enheder, der er undersøgt for at løse de ovennævnte begrænsninger, er en ejendommelig organisk transistor kaldet OCMFET for nylig blevet foreslået som et gyldigt alternativ til frihandelsaftaler og FED’er18. Ud over de standardfunktioner, der tilbydes af den organiske elektronikteknologi, såsom billige materialer og fremstillingsteknikker, optimale mekaniske og kemiske egenskaber, optisk gennemsigtighed og biokompatibilitet, tilbyder OCMFET også en ultrahøj opladningsfølsomhed (på grund af sin dobbeltporterede struktur) uden behov for en ekstern referenceelektrode. Desuden har denne organiske sensor den bemærkelsesværdige evne til at fornemme forskellige analysand / fysiske parametre, afhængigt af den specifikke funktionalisering af dens sensorområde, som er adskilt fra transistorområdet19,20. Alle disse funktioner kan bekvemt udnyttes til erhvervelse af forskellige parametre inden for en cellulær kultur. Især ud over at være i stand til at opdage den neuronale / hjerte elektriske aktivitet, er det også muligt at udnytte den ultrahøje pH-følsomhed, der tilbydes af OCMFET’s ejendommelige dobbeltportede struktur ved hjælp af en simpel fysisk funktionalisering21 til pålideligt at overvåge de små lokale pH-variationer forårsaget af cellulær metabolisk aktivitet.
I in vitro-celle biosensing er overvågningen af cellulær metabolisk aktivitet en stærk indikator for kulturens tilstand og kan bruges til at vurdere den cellulære reaktion på forskellige stimuli, såsom lægemiddeladministration og elektrisk stimulation22,23. Desuden er overvågning af både de elektriske og metaboliske aktiviteter i det specifikke tilfælde af neurale applikationer af stor interesse, især i farmakologi og toksikologi24. Med den hensigt bekvemt at imødekomme kravene i moderne in vitro elektrofysiologi og samtidig tilbyde alle fordelene ved OCMFET, en enhed kaldet Micro OCMFET Array (MOA) er for nylig blevet indført. MOA er et OCMFET-baseret array med specialiserede sensingområder specielt designet til in vitro cellulær interfacing, der muliggør multiparametrisk analyse af elektrogene celler kulturer. Især to MOA-kanaler har større sensingområder for at maksimere deres følsomhed og kan selektivt funktionaliseres til at overvåge specifikke parametre af interesse, såsom pH-variationer af kulturmediet. De andre OCMFET’er i strukturen fungerer som ekstracellulære elektriske aktivitetssensorer. Figur 1 viser strukturen af en 16 kanal MOA. Denne evne, kombineret med fraværet af en ekstern referenceelektrode, gør MOA til et meget interessant værktøj til in vitro-applikationer. Dette arbejde præsenterer den trinvise fabrikation protokol af en multisensing MOA for in vitro påvisning af de elektriske og metaboliske aktiviteter af neuroner og kardiomyocytter. Figur 2 viser de vigtigste fabrikationstrin, de anvendte materialer og enhedens struktur.
I modsætning til tidligere metoder til fremstilling af OCMFETs til cellulære applikationer18,29, den foreslåede metode er specielt designet til at forberede MOAs, der samtidig kan opdage elektrisk og metabolisk cellulær aktivitet. Desuden har denne tilgang til opnåelse af pH-følsomhed den fordel, at den er kompatibel med standardfabrikationsprotokoller og ikke indebærer nogen kemisk ændring af sensingområdet (dette aspekt sikrer hele enhedens biokompatibilitet). pH-følsomheden opnås ved hjælp af det samme materiale, der anvendes som en gate dielektrisk (dvs. den biokompatibile Parylen C), hvilket gør denne tilgang hurtig og reproducerbar.
Det endelige resultat af denne tilgang er et fleksibelt, gennemsigtigt, billigt og multisensing organisk værktøj til in vitro cellulære applikationer. Det faktum, at dette kan opnås ved hjælp af en enkelt transistorstruktur og en simpel fysisk ændring af sensingområdet, øger fordelene ved brugen af organiske elektroniske materialer og metoder. Da OCMFET’s transduktionsprincip ikke udelukkende afhænger af det specifikke halvleder- eller FG-materiale, kan hele processen ændres og opskaleres afhængigt af den specifikke anvendelse.
Et kritisk aspekt af den foreslåede teknik er relateret til reproducerbarheden af plasmaaktiveringsteknikken. For at opnå ensartede resultater skal både Parylen C-tykkelsen og dens ætsningshastighed kontrolleres. Hyppig kalibrering af Parylen C-aflejringsprocessen og plasmarenseren er absolut nødvendig. Andre kritiske aspekter, som også bidrager til reproducerbarheden af processen, er omhyggelig håndtering af enheden og aflejringen af den organiske halvleder. En simpel drop-casting teknik blev brugt her, som i sig selv udgør reproducerbarhed begrænsninger. For at minimere disse problemer, som beskrevet i protokoltrin 10.1, skal den samme mængde halvlederopløsning anvendes hver gang, og fordampningen af opløsningsmidlerne bør standardiseres så meget som muligt. Holde en konstant temperatur ved hjælp af en kogeplade og dækker substratet efter hver dråbe aflejring vil bidrage til at bremse fordampning proces. For yderligere at minimere dette problem kan depositionsteknikken (f.eks. ved hjælp af en inkjetudskrivningsmetode) skiftes30.
En begrænsning af den foreslåede protokol skyldes karakteren af funktionaliseringen af OCMFET til pH-sensing. Stabiliteten af pH-sensorerne er begrænset til et par uger26. Stabilitetsvinduet i den foreslåede tilgang er imidlertid tilstrækkeligt stort til at dække de standardinkubationstider, der er nødvendige for neuronal kulturvækst (2-3 uger). Andre former for sensing område funktionalisering bør overvejes for længere eksperimenter. Fabrikationsprotokollen bruger en dedikeret tilbagekontakt, der giver elektrisk adgang til FG’erne. Denne kontakt, som efterlades flydende under enhedens normale drift, kan udnyttes til elektrisk karakterisering af enheden og funktionalisering af sensingområderne ved hjælp af forskellige teknikker (f.eks. elektrodeposition).
Denne procedure er en praktisk måde at forberede en multi-sensing enhed til cellulære applikationer uden behov for ekspansive materialer eller renrum faciliteter. På trods af præstations- og stabilitetsbegrænsningerne på grund af ansættelsen af en organisk halvleder og fysisk (ikke kemisk) funktionalisering af sensorområdet kan lignende tilgange bruges til at forberede billige (og potentielt engangs), mekanisk fleksible og optisk gennemsigtige sensorer og biosensorer, som kan give forskere i cellulær biologi, vævsteknik og neurovidenskab nye specialiserede værktøjer til at studere cellulære systemer in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender finansiering fra EU’s Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. 882897-Search&Rescue-projektet og PON-projektet “TEX-STYLE” ARS01_00996, PNR 2015-2020.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
ABS filament | |||
Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
Gold | Local seller | ||
Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
Petri dishes | |||
Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
Thermal evaporator unit | |||
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |