ここでは、 インビトロ セルラーインターフェース用の有機電変調電変調トランジスタ(OCMFET)ベースのデバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイと呼ばれるこの装置は、柔軟で低コストで参照のないデバイスであり、電気活性細胞培養の電気的および代謝的活動のモニタリングを可能にします。
現代の電気生理学は、ますます高度化するツールと材料の並行開発によって常に促進されてきました。さらに、この分野での発見は、過去50年間の印象的な成果を最終的に決定した前後のプロセスで技術の進歩を推進してきました。しかし、セルラーインターフェースに使用される最も採用されているデバイス(すなわち、トランジスタに基づくマイクロ電極アレイやマイクロエレクトロニクスデバイス)は、高コスト、材料の剛性、外部参照電極の存在など、いくつかの制限を依然として有しています。これらの課題を部分的に克服するために、有機バイオエレクトロニクスと呼ばれる新しい科学分野が発展し、低コスト、より便利な材料、革新的な製造技術などの利点をもたらしました。
細胞培養との間に便利にインターフェースするために、過去10年間にいくつかの興味深い新しい有機デバイスが提案されています。本論文では、有機電変調された電界効果トランジスタ(OCMFET)に基づく細胞インターフェース用デバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるこれらのデバイスは、有機エレクトロニクスの利点とOCMFETの独特の特徴を組み合わせて、体心筋細胞およびニューロンの電気的および代謝活動を体質で監視することができる透明で柔軟で参照のないツールを準備し、電気細胞モデルのマルチパラメトリック評価を可能にします。
ニューロンや心筋細胞などの電気活性細胞のインビボモニタリングは、人間の脳、機能接続性研究、薬理学、毒物学の基礎研究アプリケーションにおいて有効かつ強力なアプローチを表しています。このような研究のために通常使用されるツールは、主にマイクロ電極アレイ(MEA)1,2,3,4,5に基づいており、ますます効率的で強力な電界効果デバイス(FET)6,7,7,8,9,10,11,12.これらの2つのデバイスファミリーは、ニューロンと心筋細胞の電気活動のリアルタイムモニタリングと刺激を可能にし、通常は堅牢性、使いやすさ、信頼性によって特徴付けられる。これらの特徴はMEAおよびFEDを電気生理学的適用のための金本位にし、標準的な細胞培養物、オルガノピックの脳スライスおよび三次元オルガノイド13、14、15、16とのインターフェイスに現在使用されている。MEAやFEDは、その幅広い使用と印象的な特徴にもかかわらず、高コスト、材料の剛性、および通常はかさばる参照電極の存在など、いくつかの制限を提示し、測定液環境に配置する必要があり、デバイスの適切な動作に必要です。
細胞インターフェースの代替ソリューションを探求するために、有機材料と革新的な製造技術に基づく電子機器の研究に過去10年間で多くの努力が投資されてきました。前述の制限に対処するために研究されたいくつかの有機デバイスの中で、OCMFETと呼ばれる特異な有機トランジスタが最近MEAおよびFEDs18に代わる有効な代替手段として提案されている。低コストの材料や製造技術、最適な機械的・化学的特性、光学透過性、生体適合性などの有機エレクトロニクス技術が提供する標準機能に加えて、OCMFETは外部参照電極を必要とせずに超高電荷感度(二重ゲート構造による)を提供します。さらに、この有機センサは、トランジスタ領域19,20から分離されたセンシング領域の特定の機能化に応じて、異なる検体/物理的パラメータを検出する顕著な能力を有する。これらの機能はすべて、細胞培養内のさまざまなパラメータを取得するために便利に利用できます。特に、神経/心臓の電気的活性を検出できることに加えて、細胞代謝活性に起因するわずかな局所pH変動を確実にモニタリングする単純な物理的機能化21を用いてOCMFETの超高pH感受性を利用することもできる。
インビトロ細胞バイオセンシングにおいて、細胞代謝活性のモニタリングは、培養の状態の強力な指標であり、薬物投与および電気刺激などの様々な刺激に対する細胞応答を評価するために使用することができる22,23。さらに、神経用途の特定の場合には、特に薬理学および毒物学24において、電気的および代謝活動の両方をモニタリングすることは大きな関心事である。OCMFETの利点を提供しながら、現代の体外電気生理学の要件に便利に対処することを意図して、マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるデバイスが最近導入されました。MOAはOCMFETベースのアレイで、インビトロ細胞インターフェース用に特別に設計された特殊なセンシング領域を備え、電気原性細胞培養のマルチパラメトリック分析を可能にします。特に、2つのMOAチャネルは、その感度を最大化するためにより大きなセンシング領域を有し、培養培地のpH変動などの関心のある特定のパラメータを監視するために選択的に機能化することができる。構造内の他のOCMFETは、細胞外の電気活動センサーとして機能する。図1は、16チャンネルMOAの構造を示しています。この機能は、外部参照電極の存在と組み合わせることで、MOAをインビトロアプリケーションにとって非常に興味深いツールにします。この研究は、ニューロンおよび心筋細胞の電気および代謝活動のインビトロ検出のための多感性MOAの段階的な製造プロトコルを提示する。図2は、主な製造手順、使用する材料、およびデバイス構造を示しています。
細胞アプリケーション用OCMFETの製造のための以前の方法とは異なり、提案された方法は、電気的および代謝的細胞活動を同時に検出できるMOAを調製するように特別に設計されている。さらに、pH感度を達成するためのこのアプローチは、標準的な製造プロトコルと互換性があり、センシング領域の化学修飾を伴わないという利点を有する(この側面は、デバイス全体の生体適合性を保証する)。pH感度は、ゲート誘電体(すなわち、生体適合性のパリレンC)として使用されるのと同じ材料を使用して達成され、このアプローチは速く、再生可能にする。
このアプローチの最終結果は、 インビトロ セルラーアプリケーション用の柔軟で透明で低コストで多量感性の有機ツールです。これは、単一のトランジスタ構造とセンシング領域の簡単な物理的な変更を使用して得ることができるという事実は、有機電子材料および方法の使用によって提供される利点を追加します。また、OCMFETの導入原理は特定の半導体やFG材料に厳密に依存しないため、プロセス全体を特定の用途に応じて変更・アップスケールすることができます。
提案された技術の重要な側面は、プラズマ活性化技術の再現性に関連している。一貫した結果を得るためには、パリレンCの厚さおよびそのエッチングレートの両方を制御する必要があります。パリレンC蒸着プロセスとプラズマクリーナーの頻繁なキャリブレーションは絶対に必要です。また、プロセスの再現性にも寄与する重要な側面として、デバイスの取り扱いや有機半導体の堆積化が重要です。ここでは、再現性の限界を本質的に生かしたシンプルなドロップキャスティング技術が使用されました。これらの問題を最小限に抑えるために、プロトコルステップ10.1で説明したように、同じ量の半導体溶液を毎回使用し、溶媒蒸発を可能な限り標準化すべきである。ホットプレートを使用して一定の温度を維持し、各液滴堆積後に基板を覆うことは、蒸発プロセスを遅くするのに役立ちます。この問題をさらに最小限に抑えるために、堆積技術(例えば、インクジェット印刷法を用いて)を切り替え可能である。
提案されたプロトコルの制限は、pHセンシングのためのOCMFETの機能化の性質に由来する。pHセンサーの安定性は、数週間26に制限されています。しかし、提案されたアプローチの安定性ウィンドウは、神経培養の成長に必要な標準的なインキュベーション時間(2〜3週間)をカバーするのに十分大きい。他のタイプのセンシング領域の機能化は、より長い実験のために考慮されるべきである。製造プロトコルは、専用のバックコンタクトを使用して、FGsへの電気的アクセスを可能にします。この接触は、デバイスの正常な動作中に浮いたままで、異なる技術(例えば、電着)を使用して、デバイスの電気的特性とセンシング領域の機能化のために利用することができる。
この手順は、広い材料やクリーンルーム設備を必要とせずに、セルラーアプリケーション用のマルチセンシングデバイスを準備するための便利な方法を表します。有機半導体の採用とセンシング領域の物理的(化学的ではない)機能化による性能と安定性の制限にもかかわらず、同様のアプローチを使用して、低コスト(および潜在的に使い捨て)、機械的に柔軟で光学的に透明なセンサーとバイオセンサーを準備することができ、細胞生物学、組織工学、神経科学の研究者に 生体外の細胞システムを研究するための新しい特殊なツールを提供することができます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムによる助成金第882897-検索&レスキュープロジェクトおよびPNR2015-2020 ARS01_00996 PONプロジェクト「TEX-STYLE」の助成金を認めている。
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
ABS filament | |||
Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
Gold | Local seller | ||
Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
Petri dishes | |||
Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
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Thermal evaporator unit | |||
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |