空间距离是评估内皮细胞与心肌细胞分层共培养模型中缺氧/复氧损伤的关键参数，首次表明优化共培养的空间环境对于提供有利条件十分必要 体外 用于检测内皮细胞在心肌细胞保护中作用的模型。
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本文内容
摘要
摘要
缺血性心脏病是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因。再灌注会在缺血基础上造成额外损伤。内皮细胞（ECs）可通过细胞间相互作用保护心肌细胞（CMs）免受再灌注损伤。共培养体系有助于研究细胞间相互作用的作用机制。混合共培养是最简单的方法，但其局限性在于无法对单一细胞类型进行独立处理和后续分析。为探究ECs是否能够以剂量依赖方式减轻CMs的细胞损伤，以及通过调节两种细胞系之间的接触距离是否可进一步优化这种保护作用，我们采用小鼠原代冠状动脉内皮细胞与成年小鼠心肌细胞，测试了三种细胞培养插入式装置，其细胞层间距分别为0.5、1.0和2.0 mm。在仅含CMs的培养条件下，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放量评估的细胞损伤在缺氧期间显著增加，且在2.0 mm间距下再氧合时进一步加重，相较于0.5 mm和1.0 mm间距更为明显。当ECs与CMs处于近乎直接接触状态（0.5 mm）时，缺氧后CMs的再氧合损伤仅出现轻微缓解。当空间距离为1.0 mm时，该缓解作用显著增强。在2.0 mm间距下，ECs在缺氧及缺氧/再氧合阶段均显著减轻了CMs的损伤，表明足够的培养间距对于ECs与CMs之间的信号交流至关重要，使分泌的信号分子得以循环并充分激活保护性通路。我们的研究首次提示，优化EC/CM共培养的空间环境对于提供有利的 体外 用于评估内皮细胞在心肌保护中对抗模拟缺血/再灌注损伤作用的模型。本报告旨在为研究人员提供使用该重要模型的逐步操作指南。
引言
缺血性心脏病是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因1,2。然而，再灌注治疗过程本身可导致心肌细胞死亡，称为心肌缺血/再灌注（IR）损伤，目前对此仍无有效治疗方法3。已有研究表明，内皮细胞（ECs）可通过分泌旁分泌信号以及细胞间相互作用来保护心肌细胞（CMs）4。
共培养模型已被广泛用于研究自分泌和/或旁分泌的细胞间相互作用对细胞功能和分化的影响。在各种共培养模型中，混合共培养是最简单的一种，即将两种不同类型的细胞以特定的细胞比例直接接触，共同培养于同一个培养空间中5。然而，由于细胞群体混合在一起，难以对不同细胞类型进行独立处理，也无法方便地对单一细胞类型进行后续分析。
既往研究表明，缺氧和缺血性损伤可导致细胞膜完整性显著受损，表现为乳酸脱氢酶（LDH）的释放增加。这种损伤在复氧过程中进一步加重，模拟了再灌注损伤6,7,8。本实验方案的目标是验证以下假设：内皮细胞（ECs）的存在能够....
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方案
1. 实验准备/铺板
- 根据制造商的说明培养心肌细胞（CMs）和内皮细胞（ECs）。
- 当两种细胞系从供应商处收到后，进行解冻处理，并用新鲜培养基洗涤后接种于T25培养瓶中。建议使用与细胞来源相同的供应商提供的细胞培养基。次日更换新鲜培养基，待细胞达到汇合状态后使用。
- 将细胞培养用的培养箱维持在37 °C，含21% O2、5% CO2 和74% N2 的环境，并保持充分湿度。
注：本实验方案中所用的小鼠原代冠状动脉内皮细胞来源于C57BL/6小鼠的冠状动脉，成年小鼠心肌细胞则来源于成年C57BL/6J小鼠心脏，均为商业获取（参见 材料表）。
- 在无菌条件下将CMs接种至24孔板的底部（下层）。24小时后，将ECs接种至共培养孔的插入式培养小室（或上层部分）。ECs接种24小时后，将含ECs的插入式小室置于CMs所在的孔板底部，开始共培养阶段。共培养至少12–24小时后方可用于实验。以下将详细描述这些步骤。
- 在光学显微镜下评估CM细胞系的汇合度。当培养瓶中的细胞汇合度达到90%–100%时，即可进行实验性接种。
- 吸除含有汇合细胞的培养瓶中的培养基，对T25培养瓶加入3–5 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）进行消化。轻轻摇晃培....
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结果
本实验使用的三种插入式培养小室（A、B、C）的孔径均为 0.4 µm。它们之间的唯一区别在于插入室与底部的高度不同，从而使得两种共培养细胞层之间的距离分别为 0.5、1.0 和 2.0 mm（图3），且它们来自不同的供应商（详见材料表）。
建立一个 体外 采用两种可发生缺氧-复氧（HR）的细胞系分层共培养模型模拟缺血-再灌注（IR）损伤，检测了与内皮细胞（ECs）共培养或单独培养的心肌细胞（CMs）的细胞膜完整性。通过使用可置于CM层上方不同距离处的ECs专用插入式培养小室，进一步评估了细胞层间距对CM膜损伤程度的影响。在另一组实验中，调整ECs的接种密度，从而改变ECs与CMs的比例。此外，为区分模拟缺血与模拟IR损伤，在以下三种条件下分别开展实验：1）常氧；2）仅缺氧；3）缺氧-复氧（HR）。本模型采用24小时缺氧处理，随后进行2小时复氧。
可变距离
细胞.......
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讨论
实验方案中的关键步骤
共培养细胞模型已被用于研究心肌保护的细胞机制。因此，如何构建两个具有适当间距的独立细胞层，对于建立合适的共培养模型至关重要。研究模拟缺血-再灌注（即缺氧-复氧，HR）损伤的一个难点在于，不仅缺血（缺氧）本身，而且再灌注（复氧）过程也会加剧细胞功能障碍。因此，一个理想的模型应能反映这些特征，例如，在缺氧后复氧条件下应表现出较单纯缺氧更显著的损伤加重，同时仍能通过细胞保护性药物或策略（如本研究中的内皮细胞，ECs）减轻损伤。有趣的是，两层细胞之间的距离在构建合适的共培养模型中似乎起着重要作用。我们发现，当内皮细胞（ECs）与心肌细胞（CMs）之间的距离为1.0 mm和2.0 mm时，均可观察到预期的HR损伤反应；但更重要的是，只有在2.0 mm的距离下，内皮细胞才能在缺氧及HR条件下均稳定地发挥对细胞损伤的保护作用。
方法的改进与故障排除
共培养模型中的细胞间相互作用受到多种变量的影响，例如共培养的不同细胞群体数量、细胞类型之间的相似程度、细胞间的物理分离程度、不同群体局部.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发项目的资助。&D 服务（I01 BX003482）以及机构资金资助 M.L.R.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 成年小鼠心肌细胞（CMs） | Celprogen Inc | 11041-14 | 从成年 C57BL/6J 小鼠心脏组织中分离 |
| Countess II 自动细胞计数仪 | Invitrogen | A27977 | 用于计算细胞数量的细胞计数 |
| 生物安全柜 | Nuaire | NU425400 | 细胞培养无菌操作台 |
| 细胞培养冻存液 | Cell Biologics Inc | 6916 | 用于长期细胞系保存的细胞冷冻 |
| 细胞培养孵箱 | Nuaire | Nu-5500 | 提供正常细胞生存条件（21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, 湿润环境） |
| 细胞培养孵箱用气罐 | A-L Compressed Gases | UN1013 | 细胞培养孵箱所需气体 |
| 细胞培养小室 A（0.5 mm） | Corning Inc | 353095 | 用于内皮细胞-心肌细胞共培养（EC-CM 共培养） |
| 细胞培养小室 B（1.0 mm） | Millicell Millipore | PIHP01250 | 用于内皮细胞-心肌细胞共培养（EC-CM 共培养） |
| 细胞培养小室 C（2.0 mm） | Greiner Bio-One | 662640 | 用于内皮细胞-心肌细胞共培养（EC-CM 共培养） |
| 离心机 | Anstel Enterprises Inc | 4235 | 用于细胞接种和传代 |
| CMs 细胞培养瓶 T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | 用于 CMs 常规培养，由制造商预先包被 |
| CMs 完全细胞培养基 | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs 完全培养基 |
| CMs 无酚红完全细胞培养基 | Celprogen Inc | M11041-14PN | 乳酸脱氢酶（LDH）检测期间使用的不含酚红的 CMs 培养基 |
| CMs 细胞培养板 96 孔 | Celprogen Inc | E11041-14-96well | 用于 LDH 检测实验，由制造商预先包被 |
| CMs 缺氧细胞培养基 | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | 用于缺氧条件下（无葡萄糖、无血清）的 CMs 细胞培养 |
| Countess 细胞计数专用载片 | Invitrogen | C10283 | 用于细胞计数仪的计数载片 |
| Cyquant LDH 细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Scientific | C20301 | LDH 检测试剂盒 |
| ECs 细胞培养瓶 T25 | Fisher Scientific | FB012935 | 用于 ECs 常规培养 |
| ECs 完全细胞培养基 | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs 完全培养基 |
| ECs 无酚红完全细胞培养基 | Cell Biologics Inc | M1168PF | 乳酸脱氢酶（LDH）检测期间使用的不含酚红的 ECs 培养基 |
| ECs 细胞培养板 96 孔 | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | 用于 LDH 检测实验 |
| ECs 明胶基包被液 | Cell Biologics Inc | 6950 | 用于 ECs 培养瓶和培养板的包被 |
| ECs 缺氧细胞培养基 | Cell Biologics Inc | GPF1168 | 用于缺氧条件下（无葡萄糖、无血清）的 ECs 细胞培养 |
| 胎牛血清（FBS） | Fisher Scientific | MT35011CV | 经 USDA 认证的热灭活 FBS，适用于细胞培养与维持 |
| 缺氧培养舱 | StemCell Technologies | 27310 | 用于创建含 0.01%O2 环境的缺氧条件 |
| 缺氧舱流量计 | StemCell Technologies | 27311 | 连接缺氧气体罐以维持恒定气体流速 |
| 缺氧气体罐（0.01%O2 气瓶） | A-L Compressed Gases | UN1956 | 用于置换缺氧培养基和培养舱中的气体（0.01%O2/5%CO2/94.99%N2） |
| 显微镜 | Nikon | TMS | 用于观察细胞状态 |
| 小鼠原代冠状动脉内皮细胞（ECs） | Cell Biologics Inc | C57-6093 | 从 C57BL/6 小鼠冠状动脉中分离 |
| NUNC 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 12565269 | 用于细胞培养操作、实验、溶液配制等 |
| NUNC 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 12565271 | 用于细胞培养操作、实验、溶液配制等 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8662 | 用于细胞培养或实验过程中的细胞洗涤 |
| 酶标仪 | BioTek Instrument | 11120533 | 用于比色或荧光检测的微孔板读数 |
| 反应用 96 孔板（透明无盖） | Fisher Scientific | 12565226 | 用于 LDH 检测的酶标仪读数 |
| 用于 CMs 的胰蛋白酶/EDTA | Celprogen Inc | T1509-014 | 1×，经无菌过滤并经组织培养测试 |
| 用于 ECs 的胰蛋白酶/EDTA | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%，经细胞培养测试 |
参考文献
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....
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