Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Résumé

La distance spatiale est un paramètre clé dans l’évaluation des lésions d’hypoxie / réoxygénation dans un modèle de co-culture de couches cellulaires endothéliales et cardiomyocytaires séparées, suggérant, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes.

Résumé

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde. La reperfusion provoque des blessures supplémentaires au-delà de l’ischémie. Les cellules endothéliales (CE) peuvent protéger les cardiomyocytes (CM) contre les lésions de reperfusion par le biais d’interactions cellule-cellule. Les co-cultures peuvent aider à étudier le rôle des interactions cellule-cellule. Une co-culture mixte est l’approche la plus simple, mais elle est limitée car les traitements isolés et les analyses en aval de types de cellules uniques ne sont pas réalisables. Pour déterminer si les CE peuvent atténuer les dommages aux cellules CM en fonction de la dose et si cette protection peut être encore optimisée en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires, nous avons utilisé des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes pour tester trois types d’inserts de culture cellulaire qui variaient dans leur distance de couche intercellulaire à 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. Dans les CM seulement, les lésions cellulaires évaluées par la libération de lactate déshydrogénase (LDH) ont augmenté de manière significative pendant l’hypoxie et plus loin lors de la réoxygénation lorsque la distance était de 2,0 mm par rapport à 0,5 et 1,0 mm. Lorsque les EC et les CM étaient en contact presque direct (0,5 mm), il n’y avait qu’une légère atténuation de la lésion de réoxygénation des CM après une hypoxie. Cette atténuation a été considérablement augmentée lorsque la distance spatiale était de 1,0 mm. Avec une distance de 2,0 mm, les CE atténuaient les lésions cm pendant l’hypoxie et l’hypoxie/réoxygénation, ce qui indique qu’une distance de culture suffisante est nécessaire pour que les CE puissent communiquer avec les CM, afin que les molécules de signal sécrétées puissent circuler et stimuler pleinement les voies protectrices. Nos résultats suggèrent, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture EC/CM est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des CE dans la protection contre la CM contre les lésions simulées d’ischémie / reperfusion. L’objectif de ce rapport est de fournir une approche étape par étape permettant aux enquêteurs d’utiliser cet important modèle à leur avantage.

Introduction

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde ^1,2. Cependant, le processus de traitement de la reperfusion peut lui-même provoquer la mort des cardiomyocytes, connue sous le nom de lésion d’ischémie / reperfusion myocardique (IR), pour laquelle il n’existe toujours pas de remède efficace³. Les cellules endothéliales (CE) ont été suggérées pour protéger les cardiomyocytes (CM) par la sécrétion de signaux paracrines, ainsi que par des interactions de cellule à cellule⁴.

Les modèles de co-cu....

Protocole

1. Préparation/placage expérimental

1. Entretenez les CM et les CE conformément aux instructions du fabricant.
   1. Décongelez les deux lignées cellulaires lorsqu’elles arrivent des fournisseurs. Plaque dans des flacons T25 après avoir été lavée avec du milieu frais. Il est recommandé d’acheter chaque milieu de culture cellulaire auprès des mêmes fournisseurs que ceux auprès desquels les cellules ont été achetées. Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes.
   2. Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 21 % O₂, 5 % CO₂, 74 % N₂....

Résultats

Les trois types d’inserts (A, B, C) utilisés dans cette expérience ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur de l’insert à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement, (Figure 3) et qu’elles proviennent de fournisseurs différents (pour plus de détails, voir tableau des matériaux).

Pour établir un modèle de co-culture in .......

Discussion

Étapes critiques du protocole
Des modèles de co-culture cellulaire ont été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la cardioprotection. Comment créer deux couches distinctes avec une distance significative entre elles est donc crucial pour le développement d’un modèle de co-culture approprié. Un défi dans l’étude de la lésion simulée IR, c’est-à-dire HR, est que non seulement l’ischémie (hypoxie) elle-même, mais aussi la reperfusion (réoxygénation) aggravent le dysfonctionnement cellulaire.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cardiomyocytes de souris adultes (CM)	Celprogen Inc	11041-14	Isolé du tissu cardiaque de souris adulte C57BL/6J
Compteur de cellules automatisé Countess II	Invitrogen	A27977	Comptage des cellules pour le calcul
du nombre de cellules Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Capot stérile de culture cellulaire
Culture cellulaire Congélation	de cellules moyennes Biological Logics Inc	6916	Utilisé pour la congélation cellulaire pour le stockage à long terme de lignées cellulaires
Incubateur de culture cellulaire	Nuaire	Nu-5500	Pour fournir des conditions de vie cellulaires normales (21 %O2, 5 %CO2, 74 %N2, 37° ; C, humidifié)
Incubateur de culture cellulaire Réservoir de gaz	A-L Gaz comprimés	UN1013	Gaz nécessaire pour l’incubateur de culture cellulaire  ;
Inserts de culture cellulaire A (0,5 mm)	Corning Inc	353095	Utilisés pour la co-culture EC-CM
Inserts de culture cellulaire B (1,0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Utilisés pour la co-culture EC-CM
Inserts de culture cellulaire C (2,0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Utilisé pour la co-culture EC-CM
Centrifugeuse	Anstel Enterprises Inc	4235	Pour le placage et le passage de cultures cellulaires
CMs Flacons de culture cellulaire T25	Celprogen Inc	E11041-14	Utilisé pour la culture régulière de CMs, enrobé par le fabricant
CMs Milieu de culture cellulaire complet	Celprogen Inc	M11041-14S	Milieu de culture CMs
complet CMs Milieu de culture cellulaire Complet sans phénol	Celprogen Inc	M11041-14PN	Milieu de culture CM sans rouge de phénol utilisé lors de la mesure de la LDH
CMs Plaques de culture cellulaire 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Utilisé pour les expériences de mesure de la LDH, enduit par le fabricant
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs Culture cellulaire dans des conditions hypoxiques (sans glucose ni sérum)
Lames de chambre de comptage cellulaire Countess	Invitrogen	C10283	Lames de comptage utilisées pour le compteur de cellules
Cyquant Kit de cytotoxicité	LDHThermo Scientific  ;	C20301	Kit de mesure LDH
ECs Flacons de culture cellulaire T25	Fisher Scientific  ;	FB012935	Utilisé pour la culture régulière ECs
Milieu de culture cellulaire ECs Complete	Cell Biologics Inc	M1168	Milieu de culture cellulaire
ECs Milieu complet sans phénol	Cell Biologics Inc	M1168PF	Milieu de culture ECs sans rouge de phénol utilisé lors de la mesure de la LDH
Plaques de culture cellulaire ECs 96 puits	Fisher Scientific (Costar)	3370	Utilisé pour les expériences de LDH mesure
ECs Culture Solution d’enrobage à base de gélatine	Cell Biologics Inc	6950	Utilisé pour l’enrobage des flacons et des plaques pour ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs Culture cellulaire dans des conditions hypoxiques (sans glucose ni sérum)
Sérum de veau fœtal (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI Approuvé par l’USDA pour la culture cellulaire et l’entretien
Chambre d’hypoxie	StemCell Technologies	27310	Pour créer une condition hypoxique avec un environnement 0,01 % O2
Débitmètre de chambre d’hypoxie	StemCell Technologies	27311	Pour se connecter à un réservoir de gaz hypoxique pour une vitesse d’écoulement de gaz constante
Réservoir de gaz hypoxique (0,01 % O2 Bouteille)	A-L Gaz comprimés	UN1956	Utilisé pour rincer le milieu hypoxique et la chambre (0,01 %O2/5 %CO2/94,99N2)
Microscope  ;	Nikon	TMS	Pour observer l’état cellulaire
Souris Cellules endothéliales primaires de l’artère coronaire (CE)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolé de l’artère coronaire de souris C57BL/6
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	Pour le processus de culture cellulaire, les expériences, la préparation de solutions, etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	Pour le processus de culture cellulaire, les expériences, la préparation de solutions, etc.
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Utilisé pour le lavage cellulaire pendant la culture ou les expériences
Lecteur de plaque	Instrument BioTek	11120533	Lecture de plaque colorimétrique ou fluorométrique
Réaction 96 Bien pâle (transparent sans couvercle)	Fisher Scientific	12565226	Utilisé pour la lecture de plaque de mesure LDH
Trypsine/EDTA pour CM	Celprogen Inc	T1509-014	1 x stérile filtré et testé pour culture tissulaire
Trypsine/EDTA pour EC	Cell Biologics Inc	6914/0619	0,25 %, testé pour la cuture cellulaire