空間距離は、別々の内皮細胞層と心筋細胞層の共培養モデルにおける低酸素/再酸素化傷害を評価する際の重要なパラメータであり、心筋細胞保護における内皮細胞の役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するためには、共培養空間環境を最適化する必要があることを初めて示唆する。
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この記事について
サマリー
要約
虚血性心疾患は、世界中の主要な死因および障害である。再灌流は虚血を超えてさらなる傷害を引き起こす。内皮細胞(EC)は、細胞間相互作用を介して心筋細胞(CM)を再灌流傷害から保護することができる。共培養は、細胞間相互作用の役割を調査するのに役立ちます。混合共培養は最も単純なアプローチですが、単一細胞型の単離処理および下流分析は実現不可能であるため、制限されています。ECがCM細胞損傷を用量依存的に減弱させることができるかどうか、およびこの保護が2つの細胞株間の接触距離を変えることによってさらに最適化され得るかどうかを調べるために、我々はマウス原発性冠状動脈内皮細胞および成体マウス心筋細胞を使用して、細胞間層間距離が0.5で変化した3種類の細胞培養インサートを試験した。 それぞれ1.0、および2.0mm。CMsのみでは、乳酸脱水素酵素(LDH)放出によって評価された細胞傷害は、低酸素状態の間、およびさらに再酸素化時に、距離が0.5および1.0mmと比較して2.0mmであったときに有意に増加した。ECとCMがほぼ直接接触していたとき(0.5mm)、低酸素症後のCMの再酸素化傷害の軽度の減衰しかなかった。この減衰は、空間距離が1.0mmのときに有意に増加した。2.0mmの距離では、ECは低酸素および低酸素/再酸素化の両方でCM傷害を減衰させ、ECがCMとクロストークするために十分な培養距離が必要であることを示し、分泌されたシグナル分子が循環し、保護経路を完全に刺激することができる。我々の知見は、EC/CM共培養空間環境を最適化することが、模擬虚血/再灌流傷害に対するCM保護におけるECの役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するために必要であることを初めて示唆する。このレポートの目標は、研究者がこの重要なモデルを有利に活用するための段階的なアプローチを提供することです。
概要
虚血性心疾患は、世界中の死因および障害の主要な原因である1,2。しかし、再灌流の治療プロセスは、それ自体が心筋虚血/再灌流(IR)傷害として知られる心筋細胞死を引き起こす可能性があり、有効な治療法はまだない3。内皮細胞(EC)は、パラクリンシグナルの分泌、ならびに細胞間相互作用を通じて心筋細胞(CM)を保護することが示唆されている4。
細胞共培養モデルは、細胞機能および分化に対するオートクリンおよび/またはパラクリン細胞間相互作用の役割を調査するために広く使用されてきた。共培養モデルの中で、混合共培養が最も単純であり、2つの異なるタイプの細胞が所望の細胞比5で単一の培養区画内で直接接触している。しかし、細胞型間の別々の処理と単一の細胞型の下流分析は、混合集団を考えると容易には実現不可能である。
以前の研究では、低酸素および虚血性の侮辱が、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出によって測定される細胞膜の完全性に重大な損傷を引き起こすことが示された。この傷害は、再酸素化時に悪化し、再灌流傷害を模倣する6、<....
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プロトコル
1. 実験準備・めっき
- CM および EC は、製造元の指示に従って保守してください。
- 両方の細胞株がベンダーから到着したら解凍します。新鮮な培地で洗浄した後にT25フラスコにプレートする。各細胞培養培地は、細胞が購入したのと同じベンダーから購入することをお勧めします。翌日、培地で細胞をリフレッシュし、コンフルエントなときに使用します。
- 細胞培養インキュベーターを21%O2、5%CO2、74%N2で37°Cに維持し、加湿しておく。
注:このプロトコルで使用されるマウス初代冠状動脈内皮細胞はC57BL/6マウスの冠状動脈から単離され、成体マウス心筋細胞は成体C57BL/6Jマウス心臓から単離され、商業的に入手可能である( 材料表を参照)。
- CMを滅菌条件下で24ウェルプレートの底部(下層)にプレートする。24時間後、ECを共培養ウェルのインサート(または上位部分)にプレートする。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMプレートベース上に置き、共培養期間を開始した。使用前に細胞を少なくとも12〜24時間共培養させる。これらの手順については、以下で詳しく説明します。
- CM細胞株コンフルエント性を光学顕微鏡下で推定する。細胞が培養フラスコ内で90%〜100%コンフルエントであるよ....
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結果
この実験で使用した3種類のインサート(A、B、C)はすべて、同じ孔径0.4μmです。両者の唯一の違いは、挿入からベースまでの高さで、2つの共培養細胞層間の距離をそれぞれ0.5、1.0、2.0mmにすることができ(図3)、異なるベンダーからのものである(詳細については 材料表を参照)。
IR損傷をシミュレートするためにHRを受ける2つの細胞株の別々の層を有する in vitro 共培養モデルを確立するために、我々はECの有無にかかわらず共培養されたCMの細胞膜完全性を調べた。CM層より上のさまざまな距離に配置できるEC用の別のインサートを利用することで、CMの膜損傷の重症度に対する細胞層距離の差異効果も評価することができました。別の実験セットでは、ECの密度、したがってECとCMの比率を変化させました。さらに、シミュレートされた虚血とシミュレートされたIR損傷を区別するために、実験は、1)正常酸素症、2)低酸素のみ、および3)HRの条件下で行った。このモデルでは、24時間の.......
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ディスカッション
プロトコルの重要なステップ
細胞共培養モデルは、心臓保護の細胞機構を研究するために使用されてきた。したがって、それらの間に意味のある距離を持つ2つの別々のレイヤーを作成する方法は、適切な共同文化モデルの開発にとって非常に重要です。シミュレートされたIR、すなわちHR、傷害を研究する際の課題は、虚血(低酸素症)自体だけでなく、再灌流(再酸素化)も細胞機能障害を悪化させることである。したがって、現実的なモデルは、例えば、低酸素単独ではなく、低酸素症後の再酸素化による傷害の十分に増加したことを実証することによって、これらの特性を反映する必要があるが、それでも細胞保護薬または我々の場合、ECの存在などの戦略による傷害の減衰を可能にする。興味深いことに、2つの細胞層間の距離は、適切な共培養モデルの開発において重要な役割を果たしているようである。ECとCMの間の距離が1.0mmと2.0mmであることを実証することができたが、さらに重要なことに、低酸素状態とHR状態の両方でECが存在することによって、わずか2.0mmのみが細胞傷害保護に一貫して好ましい結果をもたらした。
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開示事項
著者らは利益相反がないと宣言しています。
謝辞
この研究は、部分的には、米国退役軍人省生物医学研究所R&Dサービス(I01 BX003482)とM.L.R.への機関資金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 成体マウス心筋細胞(CM) | Celprogen Inc | 11041-14 | 成体C57BL/6Jマウス心臓組織から単離 |
| 自動セルカウンターカウント | II Invitrogen | A27977 | 細胞数を計算するための細胞カウント |
| バイオセーフティキャビネット | Nuaire | NU425400 | 細胞培養滅菌フード |
| 細胞培養凍結培 | Cell Biologics Inc | 6916 | 長期細胞株保存のための細胞凍結に使用 |
| 細胞培養インキュベータ | Nuaire | Nu-5500 | 正常な細胞生活条件(21%O2、5%CO2、74%N2、37°C、加湿) |
| 細胞培養インキュベーター ガスタンク | A-L 圧縮ガス | UN1013 | 細胞培養インキュベーターに必要なガス |
| 細胞培養インサートA (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | EC-CM共培養に使用 |
| 細胞培養インサートB (1.0 mm) | ミリセルミリポア | PIHP01250 | EC-CM共培養に使用 |
| 細胞培養インサートC (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | EC-CM共培養 |
| 遠心分離機 | Anstel Enterprises Inc | 4235 | 細胞培養のメッキと継代用 |
| CMs 細胞培養フラスコ T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | CMsレギュラーカルチャーに使用、メーカーCMsコーティング |
| 細胞培養培地コンプリート | セルプロゲン社 | M11041-14S | CMs培養コンプリート培地 |
| セル | プロゲン社 | M11041-14PN | CMs LDH測定時に使用したフェノールレッドなしの培地 |
| CMs細胞培養プレート 96well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | LDH測定の実験に使用され、メーカーCMによってコーティング |
| されました 低酸素細胞培養培地 | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs 低酸素条件下での細胞培養(グルコースおよび血清フリー) |
| Countess細胞計数チャンバースライド | Invitrogen | C10283 | セルカウンターCyquant |
| LDH細胞毒性キット | に使用される計数スライドサーモサイエンティフィック | C20301 | LDH測定キット |
| ECs 細胞培養フラスコ T25 | Fisher Scientific | FB012935 | ECs レギュラーカルチャー |
| ECs 細胞培養培地 コンプリート | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs 培養コンプリート培地 ECs |
| 細胞培養培地 コンプリートフェノールフリー | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs フェノールレッドを含まない培地 LDH測定時の使用 |
| ECs 細胞培養プレート 96 well | フィッシャーサイエンティフィック (Costar) | 3370 | LDHの実験に使用測定 |
| ECs 培養ゼラチンベースのコーティングソリューション | Cell Biologics Inc | 6950 | ECs |
| ECs 低酸素細胞培養培地 | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs 低酸素条件下での細胞培養 (グルコースおよび血清フリー) |
| シ胎児血清 (FBS) | フィッシャーサイエンティフィック | MT35011CV | FBS-HI USDA 細胞培養および維持のための承認 |
| 低酸素チャンバー | StemCell Technologies | 27310 | 0.01%O2環境で低酸素状態を作り出す |
| 低酸素チャンバー流量計 | StemCell Technologies | 27311 | 低酸素ガスタンクと接続して一定のガス流速を実現 |
| 低酸素ガスタンク (0.01%O2 Cylinder) | A-L 圧縮ガス | UN1956 | 低酸素培地およびチャンバー(0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| 顕微鏡のフラッシュに使用されます | Nikon | TMS | 細胞の状態を観察するには |
| マウス一次冠動脈内皮細胞(EC) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | C57BL/6マウスの冠状動脈から単離 |
| NUNC 15ML CONICLチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 12565269 | 細胞培養プロセス、実験、溶液調製などに。 |
| NUNC 50ML CONICLチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 12565271 | 細胞培養プロセス、実験、溶液調製などに。 |
| リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | 培養または実験中の細胞洗浄に使用 |
| プレートリーダー | BioTek Instrument | 11120533 | 比色または蛍光プレート読み取り |
| 反応96ウェルパルテ(透明、蓋なし) | フィッシャーサイエンティフィ | 12565226 | LDH測定プレート読み取りに使用 |
| CMのトリプシン/EDTAセル | プロジェン株式会社 | T1509-014 | 1 x 滅菌フィルターおよび組織培養試験 |
| ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
参考文献
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....
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再版と許可
