Wild Caenorhabditis nematoder er forbundet med mange mikrober, ofte i tarmen lumen eller inficere tarmen. Denne protokol beskriver en metode til at berige uoverskuelige mikrober kolonisere tarmen, drage fordel af modstanden af dauer kutikula.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vist sig at være en fremragende model til at studere værtsmikrobeinteraktioner og mikrobiomet, især i forbindelse med tarmene. For nylig har økologisk prøveudtagning af vilde Caenorhabditis nematoder opdaget en bred vifte af tilknyttede mikrober, herunder bakterier, vira, svampe og mikrosporidi. Mange af disse mikrober har interessante kolonisering eller infektion fænotyper, der berettiger yderligere undersøgelse, men de er ofte uoverskuelige. Denne protokol præsenterer en metode til at berige de ønskede tarmmikrober i C. eleganer og relaterede nematoder og reducere tilstedeværelsen af de mange forurenende mikrober, der klæber til neglebånd. Denne protokol indebærer at tvinge dyr ind i dauer-udviklingsstadiet og bruge en række antibiotika- og vaskemiddelvaske til at fjerne ekstern forurening. Da dauer dyr har fysiologiske ændringer, der beskytter nematoder mod barske miljøforhold, vil eventuelle tarmmikrober blive beskyttet mod disse forhold. Men for at berigelse skal virke, skal mikroben af interesse opretholdes, når dyr udvikler sig til dauers. Når dyrene forlader dauer-scenen, formeres de enkeltvis til individuelle linjer. F1 populationer er derefter udvalgt til ønskede mikrober eller infektion fænotyper og mod synlig forurening. Disse metoder vil gøre det muligt for forskere at berige uoverskuelige mikrober i tarm lumen, som udgør en del af det naturlige mikrobiom af C. elegans og intracellulære tarmpatogener. Disse mikrober kan derefter studeres for kolonisering eller infektion fænotyper og deres virkninger på værten fitness.
Den genetiske model organisme C. elegans er en fremragende in vivo system til at studere vært-mikrobe interaktioner1,2. De har relativt enkel fysiologi sammenlignet med andre dyr, men meget af deres cellebiologi svarer grundlæggende til pattedyr, hvilket gør dem til en god model for biologisk forskning1,3,4. Derudover er de mikroskopiske, nemme at vedligeholde og forbliver gennemsigtige i hele deres korte levetid. Disse egenskaber muliggør hurtige undersøgelser af mekanismerne for værtsmikrobeinteraktioner og visualisering af in vivoinfektion og kolonisering af de genetisk bøjelige værter5,6. Endelig, C. elegans hurtigt reagerer på bakterielle, svampe, og virusinfektioner, hvilket gør dem til en fremragende model til at studere host-mikrobe interaktioner og tarmen mikrobiom7,8,9.
En stigning i prøveudtagningen af vilde C. eleganer og andre nematoder har givet mulighed for forskning i økologi af fritlevende nematoder og naturlig genetisk variation10,11. Samtidig har prøveudtagning også øget opdagelsen af naturligt forekommende biologiske patogener og mikrober, der interagerer med C. elegans12,13,14,15, hvilket fører til etablering af mange værtsmikrobemodelsystemer, der studerer interaktioner med vira, bakterier, mikrosporidi, oomyceter eller svampe16,17,18,19,20 . Typisk findes vilde C. elegans i rådnende stængler og frugter, ofte i mere tempererede klimaer, og for det meste er de selvforsørerende21. Når disse prøver bringes ind i laboratoriet, isoleres vilde nematoder i kloniske populationer, der bærer en række tilknyttede mikrobiota. Når man opdager nye mikrober af interesse for Caenorhabditis nematoder, er dyr ofte direkte screenet for infektion eller kolonisering ved mikroskopi ved hjælp af let visualiserede fænotyper. For eksempel kan virusinfektion visualiseres som en opløsning af tarmstrukturer, og mikrosporidiske stadier kan ses inde i værtsceller som sporer eller meronter14,22. Når en mikrobe af interesse opdages til fremtidig undersøgelse, skal den adskilles fra de andre forurenende mikrober, der findes i de vilde nematoder, så den kan studeres isoleret. I mange tilfælde kan mikroben af interesse ikke dyrkes in vitro, hvilket gør det vigtigt at berige mikroben i værts nematoden.
For eksempel beskriver denne protokol en vild isolate af C. tropicalis , der indeholder en bakterie, der koloniserer i tarm lumen af nematoder, klæber til tarm epitelcellerne på en retningsbestemt måde. Fænotypisk vokser bakterien vinkelret langs tarm lumens indre sider, hvilket giver det et børstelignende udseende, visualiseret på et standard Normarski-mikroskop i alle stadier af dyret, herunder dauer-scenen. Nematode vækstmedium (NGM) plade, hvorpå denne vilde C. tropicalis stamme blev dyrket indeholdt synlig forurening med andre mikrober. Denne protokol blev udviklet for at reducere yderligere forurenende mikrobiel vækst på pladerne til at studere denne ukendte klæbende bakterie. Nematoderne blev tvunget ind i dauer-scenen for at beskytte bakterierne i lumen og derefter renset ved hjælp af en række vaske. Derefter blev den ukendte bakterieart identificeret ved dissektion af tarmene og PCR-forstærkning af 16S ribosomal DNA til sekventering.
Samlet set kan denne protokol potentielt berige enhver mikrobe af interesse forbundet med en vildtfanget nematode. Bagefter, forskere vil identificere målet mikrobe, visualisere in vivo infektion eller kolonisering fænotyper via mikroskopi, og undersøgelse effekter på vært fitness eller andre aspekter af vært-mikrobe interaktioner. Isolation og undersøgelse af nye mikrobielle arter, der interagerer med Caenorhabditis nematoder, kan afdække de genetiske mekanismer i værtsimmunitet og nye paradigmer af værtsmikrobeinteraktioner, der er relevante for mikrobiel patogenese og mikrobiomundersøgelser.
Denne protokol beskriver isolering og identifikation af mikrober fra vildt isolerede Caenorhabditis nematoder ved hjælp af en række rengøringsprocedurer. Talrige mikrober er forbundet med vildt isolerede nematoder, og nogle af dem har spændende fænotyper, der kan bruges til fremtidige undersøgelser i værtsmikrobeinteraktioner og medfødt immunitet. Mange dyrkelige mikrobiom og patogene bakterier er blevet isoleret fra vilde Caenorhabditis nematoder ved hjælp af standard teknikker til in vitro bakterievækst25,26. Det er dog ikke alle mikrober, der kan dyrkes in vitro, og det bliver nødvendigt at berige dem i vilde nematoder. Nogle mikrober har en resistent spore fase, såsom mikrosporidi, og høje koncentrationer af SDS kan bruges til at dræbe de fleste bakterier og svampe, giver mulighed for specifik berigelse af sporer12. Denne protokol præsenterer en metode til at berige uoverskuelige tarmmikrober, der ikke er resistente over for SDS og antibiotikabehandling.
Den teknik, der præsenteres her, udnytter den miljøresistens, der ses hos dauerdyr på grund af fysiologiske ændringer som styrkelse af neglebånd, undertrykkelse af svælgpumpning og dækker munden med en buccal plug27. Et kritisk skridt i denne protokol er natten inkubation med forskellige antibiotika og 0,25% SDS. Dette trin bruges til at dræbe alle eksterne mikrober, mens interne mikrober forbliver intakte. Mens C. elegans dauers har vist sig at overleve SDS koncentrationer så højt på 10% for 30 min27, denne protokol bruger en moderat, men langvarig inkubation til ikke kun at dræbe mikrober, men yderligere udsætte bakterier for antibiotika. Desuden kan en moderat koncentration af SDS bidrage til at sikre, at dauers fra andre Caenorhabditis arter overlever, da eksponering af C. tropicalis til 1% SDS natten resulterede i død af alle dauer dyr. Hvis alle dauers dør, skal koncentrationen af SDS og/eller længden af eksponeringen for SDS reduceres. Omvendt, hvis F1-generationspladerne stadig har synlig forurening efter rengøring, skal SDS-koncentrationen og inkubationstiden øges.
Et andet kritisk skridt er isoleringen af enkelte dauer dyr efter rengøring. Dette trin er afgørende, da ikke alle dyr er rene efter SDS og antibiotikabehandling. Derfor placeres dyrene i midten af en 10 cm NGM plade med OP50-1 og får lov til at krybe radialt udad. Ofte er det bedst at vælge mere distale dyr, da udvidet krybe gennem OP50-1 ser ud til at hjælpe med at fjerne eventuelle overlevende mikrober fastgjort til neglebånd. Dette fører dog til en begrænsning af protokollen, da det vil være mere udfordrende at berige for en mikrobe af interesse, hvis den ikke er til stede i befolkningen med høj frekvens. Her var den klæbende Alphaproteobacteria til stede i 90%-95% af befolkningen; derfor havde de fleste rene plader mikrobiombakterien. Men hvis en mikrobe af interesse er til stede på en meget lavere frekvens i befolkningen, kan det være nødvendigt at screene mange flere F1 plader.
Denne protokol kan sandsynligvis bruges til at isolere et vilkårligt antal ikke-dyrkelige mikrober af interesse, der findes i vilde nematoder. Mikroberen skal dog være i et væv, der er beskyttet af dauer-kutikulaet, der er i stand til at overleve hos dauer-dyr, og have en observerbar fænotype hos værten. Som sådan kan denne teknik bruges til at berige andre mikrobiombakterier i tarm lumen udover Alfaproteobacteria arter beskrevet her, herunder bakterier, der ikke klæber. Protokollen blev også brugt til at berige for en fakultetsintercellulær bakterie, Bordetella atropi, som inficerer nematoden Oscheius tipulae28. Efter berigelse blev B. atropi fundet at danne kolonier på NGM-plader, hvilket viser, at en mikrobe af interesse kan opdages at være kultbar in vitro, når hurtigere voksende forurenende stoffer fjernes. Denne teknik vil sandsynligvis arbejde for mikrosproidere og vira, herunder Orsay virus, da denne evne til at berige en intracellulær bakterie. Disse mikrober skal dog være i stand til at overleve overgangen til og fra dauer.
Det er vigtigt at huske, at mens denne protokol kan udføres i et biosikkerhedsniveau 1-laboratorium, skal der opretholdes en steril teknik hele vejen igennem for at forhindre yderligere mikrobiel forurening. Protokollen kan ændres i henhold til forskerens behov, herunder typer / koncentrationer af antibiotika, procentdelen af SDS, og / eller tilsætning af svampemidler såsom nystatin. Ofte kan antallet af forurenende mikrober, der findes i en vildtisoleret nematode, variere dramatisk. Her blev det tilsyneladende tab af ikke-OP50-1 E. coli-vækst på NGM-plader brugt som udlæsning for en ren nematodestamme. Men der kan være ikke-kultable populationer af forurenende mikrober til stede, så det er vigtigt at gennemføre en metagenomics metode som 16S rRNA amplicon sekventering for at se omfanget af forurening26. Når ormen stamme er renset, det kan fryses og opbevares væk til fremtidige undersøgelser. Samlet set denne protokol giver forskerne mulighed for at berige uoverskuelige mikrober i vilde nematoder, så de kan studere effekter på vært fitness, karakterisere fænotyper af kolonisering eller infektion, og drage fordel af genetiske værktøjer til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for vært-mikrobe interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Tak til Dr. Christian Braendle og Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Field Station.
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
BD PrecisionGlide Needle – 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
Carbenicillin | Millipore-Sigma | C1389-1G | |
Cefotaxime | Millipore-Sigma | C7039-500mg | |
Chloramphenicol | Millipore-Sigma | C0378-25G | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | 11-303C | |
DreamTaq Polymerase | Fisher Scientific | EP0711 | |
Gentamycin | Millipore-Sigma | G1264-250mg | |
Kanamycin | Millipore-Sigma | K1876-1G | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Streptomycin | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
Tetracyclin | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Watch glasses | VWR | 470144-850 |