Summary
רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.
Abstract
מלנוציטים הם תאים מיוחדים שמקורם בפסגה עצבית הנמצאים בעור האפידרמיס. תאים אלה מסנתזים פיגמנט מלנין המגן על הגנום מפני קרינה אולטרה סגולה מזיקה. הפרעות בתפקוד המלנוציטים מובילות להפרעות פיגמנטריות כגון פיבלדיזם, לבקנות, ויטיליגו, מלזמה ומלנומה. דג זברה הוא מודל מצוין להבנת תפקודי מלנוציטים. נוכחותם של מלנוציטים פיגמנטיים בולטים, קלות המניפולציה הגנטית והזמינות של קווים פלואורסצנטיים טרנסגניים מקלים על חקר הפיגמנטציה. מחקר זה משתמש בקווי דגי זברה מסוג בר ודגי זברה טרנסגניים המניעים ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדמי Mitfa ו - tyrp1 המסמנים שלבים שונים של מלנוציטים.
השתקה מבוססת מורפולינו של גנים מועמדים מושגת כדי להעריך את התוצאה הפנוטיפית על פיגמנטציה של הזחל והיא ישימה לסינון מווסתי פיגמנטציה. פרוטוקול זה מדגים את השיטה ממיקרו-הזרקה לדימות ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מבוסס נתיחה של פנוטיפים באמצעות שני גנים מועמדים, פחמן אנהידראז 14 (Ca14) וגרסת היסטון (H2afv), כדי להעריך באופן מקיף את תוצאת הפיגמנטציה. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים הפרדת גנים מועמדים למפרטים ומבדילים של מלנוציטים המשנים באופן סלקטיבי את מספרי המלנוציטים ואת תכולת המלנין בכל תא, בהתאמה.
Introduction
בעוד שהשימוש במלנין להגנה מפני אור התפתח מספר פעמים ברחבי ממלכת החי, נראה כי בעלי חוליות שכללו את התהליך. תאים ייעודיים מייצרי פיגמנט עם מנגנון משוכלל לסנתז ולהכיל מלנין נשמרים מדגים לבני אדם1. עם זאת, התוצאה של פיגמנטציה היא מגוונת באופן דרמטי, נע בצבע כדי הדדיות ומציג דפוסים חיים על אינטגמנטים, העור, ושיער2. למרות הגיוון, רפרטואר הגנים המעורבים בתגובת פיגמנטציה נשמר להפליא. מרכיבי הליבה של מנגנון סינתוז המלנין, כגון אנזימי המפתח המסנתזים מלנין, מרכיבי המלנוזומים, והקישוריות במעלה הזרם למסלול האיתות, נשארים זהים במהותם בין אורגניזמים. הבדלים גנטיים עדינים מביאים לשינויים דרמטיים בדפוסי הפיגמנטציה שנצפו בין מינים3. לפיכך, גישה גנטית הפוכה באורגניזם בעל חוליות נמוך יותר, דג הזברה (Danio rerio), מציעה הזדמנות מצוינת לפענח את מעורבות הגנים בהפיכת מצב פיגמנטי4.
עוברים של דגי זברה מתפתחים מזיגוטה מופרית חד-תאית לזחל בטווח של ~24 שעות לאחר ההפריה (HPF)5. באופן מדהים, התאים המקבילים למלנוציטים - המלנופורים - הם תאים גדולים הנמצאים בדרמיס ובולטים בשל תכולת המלנין הכהה6. תאים עצביים אלה שמקורם בסמל העצבי נובעים ~ 11 hpf ומתחילים פיגמנט ~ 24 hpf 6,7. מודולי ביטוי גנים שמורים אפשרו זיהוי של גורמי מפתח המתזמרים תפקודי מלנוציטים והובילו לפיתוח קווי כתב פלואורסצנטיים טרנסגניים Tg(sox10:GFP), Tg (mitfa:GFP) ו- Tg (ftyrp1:GFP)8,9,10 המסמנים שלבים סלקטיביים של התפתחות מלנוציטים. שימוש בקווי דגים טרנסגניים אלה מאפשר לחקור את הביולוגיה התאית של מלנוציטים ברמת האורגניזם בהקשר הרקמתי עם רמזים מתאימים בהתאם לצירי הזמן ההתפתחותיים. כתבים אלה משלימים כימות מבוסס פיגמנט של מלנוציטים ומאפשרים הערכה ברורה של מספרי המלנוציטים ללא קשר לתכולת המלנין.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לפענוח הביולוגיה של מלנוציטים על ידי הערכת שני פרמטרים קריטיים, כלומר תכולת המלנין ומספרי המלנוציטים. בעוד הראשון הוא קריאה פונקציונלית נפוצה הנובעת מתגובת היפופיגמנטציה, האחרון קשור לירידה במפרט או הישרדות של מלנוציטים והוא קשור לעתים קרובות עם תנאי פיגמנטציה גנטיים או נרכשים. האסטרטגיה הכוללת של מסך גנטי הפוך זה היא להשתיק גנים נבחרים באמצעות מורפולינו ולחקור את התוצאות הספציפיות למלנוציטים. תוכן המלנין מנותח באמצעות כימות מבוסס תמונה של ערכים אפורים ממוצעים, ולאחר מכן אישור באמצעות בדיקת תוכן מלנין. מספר המלנוציטים בשלבים שונים של הבשלה מנותח באמצעות כימות מבוסס תמונה ומאושר עוד יותר באמצעות ניתוח FACS. כאן, פרוטוקול הסינון מודגם באמצעות שני גנים מועמדים, כלומר פחמן אנהידראז 14, המעורב במלנוגנזה, ווריאנט היסטון H2AFZ.2 המעורב באפיון מלנוציטים מאוכלוסיית קודמני הפסגה העצבית. בעוד הראשון משנה את תכולת המלנין ולא את מספרי המלנוציטים, האחרון משנה את מספר המלנוציטים שצוינו, וכתוצאה מכך, את תכולת המלנין בעובר. בסך הכל, שיטה זו מספקת פרוטוקול מפורט לזיהוי תפקידו של גן מועמד בפיגמנטציה ולהבחנה בין תפקידו בשליטה על מספרי המלנוציטים לעומת תכולת המלנין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בדגי זברה בוצעו בהתאמה קפדנית לאישור האתיקה המוסדית של בעלי חיים (IAEC) של CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), הודו (הצעה מספר 45a). כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הזרקת מורפולינו לעוברים של דגי זברה
- באמצעות מושך מחטים סטנדרטי, ציירו פיפטים חדים מאוד וסגורים.
- טען את התמיסה המכילה מורפולינו לתוך micropipettes באמצעות קצה microloader ולהכניס אותו לתוך מנגנון microinjector. הדקו את הבורג כראוי כדי לנעול את המיקרופיפטה.
הערה: יש צורך בסטנדרטיזציה של מינון מורפולינוס. למינון המתאים יש שיעור הישרדות של >70% ופנוטיפ ספציפי ב 24 hpf. - חותכים את קצה המיקרופיפטה באמצעות מלקחיים עדינים ומכיילים אותה11.
- כדי לכייל, הזריקו נפח 1 של תמיסת מורפולינו לתוך צינור הנימים מהמיקרופיפטה, תוך שמירה על זמן הזרקה של 1 שניות. חזור על פעולה זו חמש פעמים. באמצעות התקן 1 מ"מ = 30 nL נפח, למצוא את נפח מוזרק 5 s על ידי שמירה על צינור נימי כנגד סולם מדידה. באמצעות המידע לעיל, חשב את הזמן (בשניות) הדרוש כדי להזריק 1-3 nL לכל זריקה12.
הערה: התקן, 1 מ"מ = 30 nL, הוא ספציפי להגדרות לחץ מיקרו-מזרק וקוטר הנימים המשמש לכיול. באופן אידיאלי, ההזרקה חייבת להתבצע לתוך ממשק תא החלמון, אשר נוצר בתוך 15-20 דקות לאחר ההפריה. כדי להקל על זריקות מרובות, הפיתוח יכול להיות מעוכב מעט על ידי שמירה על עוברים בטמפרטורה נמוכה יותר (18 ° C). עם זאת, זה צריך להישמר למינימום ולא להאריך מעבר 30 דקות בשל ההשפעה המורכבת של טמפרטורה נמוכה יותר על שינויים ביטוי גנים. - הרכיבו את העוברים על צלחת פטרי יצוקה באגרוס (60 מ"מ). עורמים את העוברים בחוזקה בתוך הרכסים. בעזרת פיפטות זכוכית מלוטשות אש, מיישרים אותן בכיוון הנכון להזרקה.
- תחת מיקרוסקופ, השתמש במניפולטורים כדי לקרב את המיקרופיפטה לעובר ולהזריק בתוך ממשק תא החלמון על ידי לחיצה על מתג הרגל.
- להזריק את כל העוברים באופן דומה; לאסוף אותם בצלחת פטרי המכילה מים עוברים טריים בינוני לדגור ב 28 ° C.
- בדוק את העוברים המוזרקים לאחר 6-8 שעות. הסר את כל העוברים המתים הניתנים לזיהוי בשל האטימות הגבוהה שלהם והמשך להחליף את מי העובר לפחות פעם ביום כדי למנוע זיהום.
2. ניתוח פיגמנטציה
- הכנה לספירת מלנופורים צדיים בקו האמצע ב-3 עוברי דגי זברה dpf
- לטפל בעוברים עם 0.016% הרדמה נוירו-שרירית כדי לשתק אותם.
- כדי להרכיב את העוברים להדמיה, להוסיף כמה מיליליטר של 1.5-2% methylcellulose בצלחת פטרי (60 מ"מ) כך שהוא יוצר שכבה דקה. בעזרת פיפטה של פסטר, בחרו עוברים ומקמו אותם בעדינות במתילצלולוז כדי להגביל תנועה נוספת במהלך ההדמיה.
- התאימו את מיקומם להדמיית רוחב אופטימלית (פס גבי, פס גחון, פס חלמון ומלנופורים בקו האמצע) או גביים (מלנופורים בחלק הגבי של הראש). לרזולוציה טובה יותר של מלנופורים סמוכים, תמונה בהגדלה גבוהה יותר (>5x)
- הדמיה של ברייטפילד
הערה: הדמיית Brightfield מתבצעת באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה של 8-10x.- הניחו את צלחת הפטרי המכילה את עוברי דגי הזברה מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, התאימו את הדג בכיוון כזה כך שכל חמשת הפסים העובריים של המלנוציטים ייראו בו זמנית (גבי, גחוני, שני רוחביים, חלמון) (איור 1C). צלם תמונות במהירות באמצעות תוכנת הרכישה. במקרה שבו בעל החיים חוזר לתנועה לפני שהוא מצולם, לטבול אותו מחדש בהרדמה ולהמשיך עם הדמיה ברגע שהוא משותק מספיק.
- חזור על כך עם כל הדגים וודא שההגדלה נשארת זהה בכל תמונה.
- חישוב ערך אפור ממוצע באמצעות תוכנת ImageJ
- צלם תמונות גביות וצדדיות של 2 עוברי דגי זברה dpf.
- פתחו את התמונה לכימות ב-ImageJ באמצעות הכלי Open . השתמש בכלי צורה ביד חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. עבור אל האפשרות קבע מידות ובחר ערך אפור ממוצע | אזור. הקש M (או נתח | מדידה) כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר.
- שמירה על השטח לניתוח קבוע, לחשב את השטח האפור הממוצע עבור כל חיה בנפרד.
- שרטט גרף עמודות עם הנתונים שנרכשו (איור 2F).
- בדיקת תוכן מלנין
- ב 2 dpf, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית לאסוף ~ 25 עוברים דגי זברה.
- בצע dechorionation ידני באמצעות 1 מ"ל מחטי אינסולין ולהוסיף אותם 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge.
- יש להשליך את מדיום העובר בזהירות ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח (20 מ"מ נתרן פוספט (pH 6.8), 1% טריטון X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) עם קוקטייל מעכב פרוטאז ולהכין חלבון ליזט על ידי סוניקציה.
- להמיס את lysates ב 1 מ"ל של 1 N NaOH ולדגור את הדגימות ב 100 ° C במשך 50 דקות באמבט מים. מערבולת זה לסירוגין הומוגניזציה של lysates לחלוטין.
- בצע קריאות ספיגה של הדגימות ב- 490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
- חשבו את תכולת המלנין על-ידי השוואת ספיגת הדגימה לעקומה סטנדרטית של ריכוזים ידועים של מלנין סינתטי (איור 2G).
3. ספירת מלנופורים
הערה: ניתוח פלואורסצנטי בעוברים של דגי זברה טרנסגניים יכול להיעשות בשתי שיטות: 1) ספירת תאים חיוביים ל- GFP; 2) מדידת עוצמת פלואורסצנטיות.
- הכנה לספירה מבוססת FAC של תאים חיוביים ל-GFP בעוברים מוקדמים של דגי זברה
- אספו עוברים בגודל 200-250 ftyrp:GFP ושטפו אותם במסננת באמצעות מי עוברים רגילים. כבקרה שלילית, יש לעבד עוברי בר שליליים ל-GFP ומותאמים לשלב (Assam Wildtype)12.
- בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מ"ג / מ"ל pronase. לאחר 5-10 דקות, באמצעות פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי טרייה המכילה מי עובר רגילים. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, לאסוף ~ 100 עוברים ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.
- יש להשליך את התווך בזהירות ולהוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר קרה כקרח (חיץ החלמון). שומרים את הצינור על קרח, פיפטה את התוכן למעלה ולמטה ~ 20 פעמים עד החלמון מומס. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה שולחנית ב 4 ° C. שוב צנטריפוגה ובזהירות להשליך את הסופרנטנט.
- באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מעבירים את העוברים החלמונים לצלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין (מאגר דיסוציאציה של תאים). בצעו אותו בצלחות פטרי מרובות כדי למנוע צפיפות יתר של העוברים וטריפסיניזציה לא יעילה. השתמש פיפטה 1 מ"ל, לערבב את התמיסה המכילה את גוף העובר פעם או פעמיים כדי להקטין את הצבירה.
- יש לדגור על צלחות הפטרי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (<24 עוברי HPF) או 30 דקות (24-30 עוברי HPF). שאפו ושחררו את התרחיף מדי פעם באמצעות פיפטה של 1 מ"ל כדי לסייע להתפוררות התאים.
- במהלך תקופת הדגירה, אתחל את מכונת ציטומטר הזרימה לספירת תאים.
- מניחים מסננת תאים של 70 מיקרומטר מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל ומעבירים את המתלה הטריפסיני דרך המסננת כדי לקבל תרחיף חד-תאי. שטפו את כלי הפטרי עם אותו תרחיף כמה פעמים כדי להסיר תאים שנצמדו לפני השטח.
- סובב את הדגימות ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS).
- סובבים שוב ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant.
- לבסוף, יש להשעות מחדש את הגלולה בסרום PBS + 5% בקר עוברי ולשמור אותה על קרח עד להפעלת FACS.
- הכנת ציטומטר הזרימה
- הפעל את ציטומטר הזרימה והתחל בהפעלה.
הערה: לפני הפעלת המכונה, רוקן את פח האשפה ומלא את מיכל נוזל הנדן. - נרמל את זרימת הנחל עבור זרבובית 70 מיקרומטר (או 85 מיקרומטר). השאירו אותו ללא הפרעה למשך 10-15 דקות אם הוא לא יציב.
- הפעל את ציטומטר הזרימה והתחל בהפעלה.
- ספירת תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה
- אתחל תיקיית ניסוי חדשה וצור תרשים פיזור של פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי והיסטוגרמה של עוצמת איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC).
- טען תחילה את התאים מסוג Wild כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית (כדי לא לכלול כפילים ופסולת) ואת סף FITC.
- לאחר הגדרת השערים, הסר את הדגימה וטען את התאים שבודדו מעוברים Tg (ftyrp1:GFP) כדי לספור מלנוציטים.
הערה: כאן, מכיוון ש - ftyrp1:GFP מסמן באופן ספציפי מלנוציטים בוגרים, מספר התאים החיוביים ל- GFP מתחת לשער FITC יתאים למספר המלנוציטים. - חזור על השלב לעיל עם דגימות מוזרק מורפולינו כדי להעריך ולהשוות את מספר המלנוציטים עם הביקורת.
- מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בעוברים של דגי זברה
- בעזרת פיפטה מזכוכית פסטר אוספים 100-120 עוברים ומעבירים אותם לצלחת פטרי המכילה מי עוברים רגילים.
- ב ~ 10-12 hpf, להעביר את העוברים ל 0.003% 1-phenyl-2-thiourea כדי לעכב פיגמנטציה.
- ביצוע דכוריונציה ידנית באמצעות מחטי אינסולין להדמיית <48 עוברי HPF.
- כדי לשתק עוברים, לטפל בהם עם 0.016% טריקאין.
- כדי להרכיב עוברים להדמיה, לשים כמה מ"ל של 1.5-2% methylcellulose בצלחת פטרי (60 מ"מ) כך שהוא יוצר שכבה דקה. הוסף את העוברים למתילצלולוז כדי להגביל כל תנועה נוספת במהלך ההדמיה. הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הדגימות מתחת למיקרוסקופ. באמצעות קצה פיפטה, להתאים את החיה בכיוון הרצוי.
- רכוש תמונות באמצעות תוכנת הרכישה. עבור עוברים <24 hpf, ללכוד את כל העובר בבת אחת תחת הגדלה פי 10. עבור שלבי >24 HPF, רכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן הרכיב (תפר) אותם יחד.
- חזור על כך עם כל הדגים וודא שההגדרה לרכישה נשארת קבועה לאורך כל הניסוי.
- כימות
- נתח את התמונה עוד יותר באמצעות תוכנת ImageJ.
- פתחו את התמונה לכימות ב-ImageJ באמצעות הכלי Open .
- השתמשו בכלי צורת היד החופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח (איור 3E).
- הקש M (או נתח | מדידה) כדי לקבל מדידת עוצמת שטח שנבחר .
- שמירה על השטח לניתוח קבוע, לחשב את העוצמה הממוצעת לכל אזור עבור כל חיה בנפרד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך העבודה המתואר באיור 1 שימש לביצוע הפרעה גנטית מבוססת מורפולינו בשלב החד-תאי של דג הזברה. ניתוח פיגמנטציה בוצע בשיטות שונות, כמפורט להלן. כדי להמחיש את התוצאות המייצגות, הוזרקו כמויות מתוקננות של אנטיסנס מורפולינו המכוון לגנים h2afv ו-ca14 בשלב החלמון או התא האחד של עובר דג הזברה. הפנוטיפ הראשוני המבוסס על הדמיית שדה בהיר בוצע 48 שעות לאחר ההפריה (HPF), כאשר כל חמשת פסי המלנופור הפיגמנטיים (גבי, גחוני, חלמון, שניים רוחביים) היו ברורים.
איור 2A,B מייצג גישה לניתוח פיגמנטציה על-ידי חישוב מספר המלנופורים הצדיים לעובר. מלנופורים רוחביים נספרו ידנית בשלב 48 HPF על ידי התקרבות לאזור הצידי של דג הזברה המוטה . שיטה חלופית לכימות המלנופורים הפיגמנטיים (איור משלים S1) כוללת ספירה ידנית של המלנופורים הראשיים על ידי הדמיה של המראה הגבי של דג הזברה.
תכולת המלנין לעובר מחושבת על ידי מדידת הערך האפור הממוצע, תוך שמירה על אזור עניין קבוע בעזרת תוכנת ImageJ. איור 2C-F מראה שהערך האפור הממוצע של מורפנטים ca14 ו-h2afv היה גבוה יותר מאשר במורפנטים של קבוצת הביקורת. מכיוון שהערך האפור הממוצע עומד ביחס הפוך לתכולת המלנין, פירוק הגנים ca14 ו-h2afv הוביל לירידה בתכולת המלנין לעובר. שיטה חזקה נוספת לכימות תכולת המלנין היא שיטת ספיגה ספקטרופוטומטרית מבוססת NaOH. כפי שניתן לראות באיור 2G, תכולת המלנין הכוללת במורפנטים ca14 הייתה נמוכה יותר מאשר במורפנטים של קבוצת הביקורת.
הדמיה פלואורסצנטית חשפה שני שלבים שונים של התפתחות מלנופורים של דגי זברה: מלנופורים מוקדמים (Mitfa:GFP) ומלנופורים מתמיינים (FTYRP:GFP). השינוי המבוסס על מורפולינו הוערך באמצעות הדמיה פלואורסצנטית (איור 3A ואיור 3C). כדי לאמת עוד יותר תצפיות אלה, תדירות התאים החיוביים ל-GFP חושבה באמצעות FACS. הפלת h2afv אך לא ca14 הפחיתה באופן משמעותי את מספר המלנופורים ביחס לבקרה (איור 3A-D). יתר על כן, ניתן לחשב הפחתה בעוצמה/שטח הפלואורסצנטיות הממוצעת באמצעות תוכנת ImageJ, תוך שמירה על אזור עניין קבוע. מורפנטים H2afv מראים ירידה משמעותית בעוצמה/שטח הפלואורסצנטי הממוצע ביחס למורפנטי ביקורת (איור 3E,F).
איור 1: זרימת עבודה לגישה גנטית הפוכה לזיהוי רגולטורים של ביולוגיה של מלנוציטים באמצעות דגי זברה. (A) תרשים זרימה המתאר את זרימת העבודה הניסיונית החל ממיקרו-הזרקה ועד להערכת פיגמנטציה בשיטות שונות. (B) מחזיק מחט מיקרו-הזרקה ומיקרומניפולטור, יחד עם מיקרוסקופ מנתח, הוא מערך טיפוסי למיקרו-הזרקה של עוברים של דגי זברה בשלב חד-תאי. (C) תבנית מלנוציטים עובריים בדגי זברה ב-3 dpf המציגה את כל חמשת הפסים: גבי-צדי, שני קווי אמצע רוחביים (מחודדים על-ידי ארבעה חיצים אדומים), פס גחוני ופס חלמון. (D) כדי לחקור את תוצאת הפיגמנטציה בהזרקת מורפולינו, ניתן לספור מלנופורים של קו האמצע הצידי תחת סטריאומיקרוסקופ. תמונת שדה בהיר של אזור גבי ב 2 dpf; ניתן לכמת את תכולת המלנין על ידי מדידת ערך אפור ממוצע. (E) הערכים האפורים הממוצעים עומדים ביחס הפוך לתכולת המלנין של העובר. מלנופורים מלאים במלנין ב 2 dpf בעוברים מסוג בר. (F) ניתן לבצע בדיקת תוכן מלנין כדי להעריך את ייצור המלנין בתוך המלנופורים האלה. דגי זברה טרנסגניים המסמנים את התאים המבטאים חלבון TYRP1 ב-2 dpf. (G) ניתן לכמת תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות FACS; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. דג זברה מהונדס המסמן את התאים המבטאים חלבון Mitfa ב 1 dpf. ניתן למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל חיה באמצעות תוכנת ImageJ. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; FACS = מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספירת מלנופורים של קו האמצע הצידי, מדידת ערך אפור ממוצע ובדיקת תכולת מלנין. תמונות מיקרוסקופיות של ברייטפילד של התצוגה הצידית של מורפנטים שימשו לכימות תוכן מלנין באמצעות תוכנת ImageJ. (A) בקרה ומורנטים מסוג Histone variant h2afv (h2afv) ב-3 dpf; מימין נראים אזורי גזע מוגדלים של עוברים אלה המתארים מספרי מלנוציטים. (B) מספר המלנופורים במורפנטים h2afv מופחת באופן דרסטי ביחס לביקורת, n > 10 כל אחד ב-3 העתקים ביולוגיים. (C) תמונה מייצגת של בקרה לעומת פחמן אנהידראז 14 מורפנטים ב-2 dpf. (D) כימות מלנין של ca14 לעומת מורפנטים בקרה, n > 10 על פני 3 העתקים ביולוגיים. (E) מבט רוחבי של h2afv לעומת מורפנטים בקרה ב-2 dpf. (F) כימות תכולת מלנין של h2afv לעומת מורפנטים בקרה. מלבנים אדומים מייצגים החזר השקעה שנבחר לניתוח מבוסס ImageJ. (G) בדיקת תכולת מלנין המבוצעת בעוברים בהזרקת מורפולינו לכימות תכולת המלנין הכוללת. ממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים ± SEM.; **P < 0.01, **** P < 0.0001. מבחן t של התלמיד; קווי שגיאה הם ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: MO = morpholino; DPF = ימים לאחר ההפריה; ROI = אזור עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות תאים עם תווית פלואורסצנטית באמצעות FACS ומדידת עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת. (A) תמונות פלואורסצנטיות של ca14 ועוברי בקרה מורפנטים ב-2 dpf מקו Tg (ftyrp1: GFP), שבו המלנוציטים המתמיינים מסומנים על ידי ביטוי GFP. (B) מספר המלנופורים ב-ca14 ועוברי הבקרה הצורניים ב-2 dpf נותרו ללא שינוי, n = 3 העתקים ביולוגיים. (C) תמונות פלואורסצנטיות ב-2 dpf של h2afv ומורפנטים בקרה מקו Tg (ftyrp1:GFP). (D) מספר המלנופורים במורפנטים h2afv מופחת באופן משמעותי בהשוואה לעוברים מורפנטים של קבוצת ביקורת ב-2 dpf, n = 3 עותקים ביולוגיים. (E) תמונות פלואורסצנטיות של עוברי בקרה ועוברי h2afv מורפנטים ב-36 hpf מ-Tg (mitfa:GFP) עם מלנוציטים מסומנים. (F) MFI לכל חיה מחושב באמצעות תוכנת ImageJ ומיוצג כגרף עמודות המתאר ערכות נתונים בודדות. MFI מופחת באופן משמעותי במורפנטים h2afv בהשוואה לביקורת. מלבן אדום מייצג החזר השקעה שנבחר עבור ניתוח מבוסס תוכנה של ImageJ. n = 3 משכפלים ביולוגיים; P < 0.001, ****P < 0.0001. מבחן t של התלמיד; קווי שגיאה הם ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM); פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: MO = morpholino; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DPF = ימים לאחר ההפריה; ROI = אזור עניין; MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: כימות של מלנופורים בראש. (A) מבט גבי של h2afv ומורפנטי בקרה ב-48 HPF המראים מלנופורים ראשיים. תיבה אדומה מייצגת את החזר ההשקעה. שמירה על תחום עניין קבוע, ניתן לכמת את מספר המלנופורים של הראש באופן ידני. (B) מספר המלנופורים של הראש פחת משמעותית עם הפלת h2afv. עמודות מייצגות ממוצע גיאומטרי עם רווח בר-סמך של 95% ממספר המלנופורים של הראש לעובר עם >30 עוברים כל אחד. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: MO = morpholino; CI = רווח בר-סמך; HPF = שעות לאחר ההפריה; ROI = אזור עניין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: מיקרו-מערך של מלנוציטים ראשוניים אנושיים שטופלו ב-PTU. מפת חום מראה את הביטוי של גנים פיגמנטציה (mitf, tyrosinase, dct, mc1r) בעת טיפול במלנוציטים ראשוניים אנושיים. קיצורים: PTU = 1-phenyl-2-thiourea; Tyr = טירוסינאז. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פנוטיפ פיגמנטציה מתבטא לעיתים קרובות כשינויים בתכולת המלנין או במספר המלנוציטים נושאי הפיגמנט. השיטה המתוארת כאן מאפשרת דיסקציה של דיכוטומיה זו ומאפשרת הערכה איכותית וכמותית של תכולת המלנין ומספר המלנופורים לעובר, ללא קשר לתכולת המלנין. הפריון הגבוה של דגי הזברה, הטבע הנראה לעין של מלנוציטים פיגמנטיים והיעדר העברת מלנוזום מאפשרים דיסקציה של ביולוגיה של מלנוציטים באמצעות גישה גנטית הפוכה זו המקובלת על בדיקות סקר בתפוקה בינונית.
הבחירה בהשתקה על בסיס מורפולינו נובעת מקלות ההשתקה ומהיכולת לבחון מספר מועמדים במקביל. ישנן מגבלות מסוימות של שימוש בגישת השתקה מבוססת מורפולינו, והנחיות לשימוש ופירוש כלים יקרי ערך אלה תוארו בעבר13. בעיקרו של דבר, אימות הפנוטיפ בעת הפלה באמצעות MOs מרובים מספק פתרון מוחשי לבעיה זו. אסטרטגיה חלופית היא שימוש בהפרעה גנטית מבוססת קריספר. החדירה של הפנוטיפ מוגבלת בשל התדירות הנמוכה מטבעה של אירועים גנטיים ויכולה להיות מורכבת על ידי מוטציות הטרוגניות. זה מגביל את השימוש בו לבדיקות גנטיות הפוכות14.
הערכת פנוטיפ של הפרעות סלקטיביות מלנוציטים גורמת לעיתים קרובות לירידה בתכולת הפיגמנט עקב תגובה מלנוגנית משתנה. עם זאת, ישנם מספר גנים המפריעים לאפיון המלנוציטים ולכן גורמים לירידה בפיגמנטציה עקב ירידה במספר המלנוציטים הכולל. דיסקציה שיטתית של שני התרחישים חיונית כדי לייחס את הפונקציה המולקולרית של הגן בפיגמנטציה. מדידת תכולת המלנין מורכבת מהאופי המורכב של פולימר המלנין. מבין שתי השיטות הזמינות, כלומר מסיסות מלנין על ידי NaOH וזיהוי מבוסס HPLC של תוצרי חמצון מלנין יציבים 1H-pyrrole-2,3,5-tricarboxylic acid ו-pyrrole-2,3-dicarboxylic acid, השיטה הראשונה יכולה להתבצע באופן שגרתי בתנאי מעבדה ואילו האחרונה דורשת תקנים ספציפיים ומכשור מתוחכם15.
בנוסף, מספר העוברים הנדרש בשיטת NaOH גבוה יותר גם בשל מספר שלבים המעורבים באיתור. הידרוליזה מבוססת NaOH מסיסה במלנין ומאפשרת כימות ספקטרופוטומטרי. בעוד ששיטה זו חזקה וניתן לאמץ אותה עבור מסך בעל תפוקה בינונית (10-15 מועמדים בכל פעם), קסנטין הקיים בקסנטופורים הוא חומר מפריע פוטנציאלי בשל ספיגתו הטבועה בתחום 400-450 ננומטר16. לפיכך, יש לבצע קונקורדנציה בין קביעת ערך אפור ממוצע מבוסס ניתוח תמונה לבין בדיקת תוכן מלנין כדי לאשר את ההפחתה בתכולת המלנין.
PTU מציע כלי קל להפחית את הפיגמנטציה ולדמיין את העובר השקוף אחרת. השימוש עשוי לגרום לשינויים במשוב ולעורר שינויים במלנוציטים. אולם ראינו שינויים מזעריים בביטוי של גנים של פיגמנטציה (איור משלים S2).
ספירת המלנוציטים היא הקלה ביותר בקו האמצע הצידי ובאזור הראש, מאחר שהמלנוציטים נצפים באופן מובהק יחסית באזורים אלה (איור משלים S1). מלנופורים קוויים רוחביים נובעים מאוכלוסיית תאי גזע מלנוציטים השוכנת קרוב לגרעיני השורש הגבי18. להדמיית אוכלוסייה זו מספר יתרונות כגון מספר קבוע לעובר והבחנה ברורה. עם זאת, שני הקווים הנגדיים צריכים להיות מדומים על ידי הטיית העובר מעט; אחרת, השניים מתמזגים בגלל האופי השקוף של העובר, מה שמקשה על הספירה (איור 1C לעומת איור 2C).
מלנופורים של דגי זברה נבדלים מתאי הפיגמנט של העין שמקורם בנוירו-אקטודרם (neuro-ectoderm). אלה נבדלים על ידי המיקום שלהם בתוך העובר והם ניכרים בעין לעומת דפוס הגוף. בניסוי מבוסס FACS, ניתן להבחין בין התאים שמקורם בעין על פי גודלם מכיוון שהם קטנים משמעותית מהמלנופורים וניתן לגודר אותם באמצעות קריטריוני גודל או פיזור.
הערכות של מלנוציטים בשלבי הבשלה שונים באמצעות קווים טרנסגניים מתבצעות בקלות באמצעות כימות מבוסס תמונה. כימות מספר המלנופורים הצדיים הוא חזק מכיוון שמספרם משתנה בחלון בין 2 dpf ל -5 dpf בכל צד של העובר17. עם זאת, מספר המלנופורים הצדיים נקבע על ידי נדידה והקמת מאגר תאי גזע הקשורים לגנגליון שורש גבי18. לפיכך, כל שינוי בתהליכים אלה יכול להוביל לתצפית דומה. כדי לעקוף את הגורם המבלבל הזה, הערכה מבוססת FAC של כל המלנופורים היא פתרון מוחשי.
לחילופין, ניתן לבצע כימות של מלנופורים ראשיים כפי שמתואר באיור המשלים S1 כתחליף למספרי מלנופורים. מעניין לציין כי השינויים ברמות המצב היציב של מספרי המלנוציטים יכולים להצביע על שתי פונקציות מנוגדות עבור הגן המועמד המדובר. זה יכול לגרום לירידה במפרט של מלנוציטים ממבשרי עצב-קרסט או לגרום למוות ספציפי למלנוציטים ויש צורך לטפל בו באמצעות שיטות כגון בדיקת המנהרה. וריאציות כגון מיקרו-הזרקות ולאחריהן הדמיה של תאים חיים יאפשרו ניטור פנוטיפים ספציפיים אחרים למלנוציטים, כגון נדידה ודפוס. עניין לחוקרי תאי פיגמנט יהיה תהליך העברת המלנוזומים, שאינו פעיל במערכת הדגים. עם זאת, ניתן לחקור תנועה מלנוזומית מרוכזת במלנופורים עם שינויים בדימות תאים חיים המתוארים כאן עם שינויים. בסך הכל, הפרוטוקול המפורט המוצג במאמר וידאו זה יאפשר לחוקרי ביולוגיה של תאי פיגמנט לתשאל גנים מועמדים ולהעריך את תפקידם בביולוגיה של מלנוציטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים על תמיכת המימון של המועצה למחקר מדעי ותעשייתי בפרויקט MLP2008 והמחלקה למדע וטכנולוגיה עבור הפרויקט GAP165 לתמיכה בעבודה המוצגת בכתב יד זה. אנו מודים לג'יאשרי רנגראג'ו ולצ'טאן מישרא על עזרתם בניסויים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
