JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/62964
, , , , , , , , , ,
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48,Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care,APHP-Sorbonne university

Summary

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。

Abstract

ミクログリアは、脳に常在するマクロファージとして、環境ストレスへの応答や脳の恒常性など、いくつかの機能の基本です。ミクログリアは、広範囲の活性化表現型を採用することができる。さらに、炎症誘発性の表現型を支持するミクログリアは、神経発達障害と神経変性障害の両方に関連しています。 インビトロ 研究は、特定の細胞型における潜在的な治療戦略を評価するための研究で広く使用されています。これに関連して、初代ミクログリア培養物を用いて in vitro でミクログリア活性化および神経炎症を研究することは、ミクログリア細胞株または幹細胞由来ミクログリアよりも関連性が高い。ただし、一部の初代培養物を使用すると、再現性が不足する可能性があります。このプロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離する再現可能で関連性のある方法を提案しています。mRNA発現定量およびCy3ビーズ貪食アッセイによる4時間および24時間後のいくつかの刺激を用いたミクログリア活性化がここで実証される。今回の研究は、幼若発生段階から生理学的に重要なミクログリアを分離するための容易に再現可能な技術を提供することが期待されます。

Introduction

ミクログリアは、初期胚発生中に神経上皮に移動する卵黄嚢の赤血球生成前駆体に由来する中枢神経系常在マクロファージ様細胞です1。免疫機能とは別に、神経発達中、特にシナプス形成、ニューロン恒常性、髄鞘形成にも重要な役割を果たします2。成人期には、ミクログリアは環境を継続的にスキャンするための長い細胞プロセスを発達させます。脳損傷や脳疾患などの恒常性破壊の場合、ミクログリアは形態学的外観を変化させてアメーバ状を採用し、損傷領域に移動し、多くの細胞保護因子または細胞毒性因子を増加させて放出する可能性があります。ミクログリアは、その発生段階および持続した傷害の種類に応じて不均一な活性化状態を有する3,4,5。この研究では、これらの活性化状態は、炎症誘発性/食性、抗炎症性、免疫調節性の3つの異なる表現型に大きく分類され、実際には状況がより複雑になる可能性があることを念頭に置いています6。

脳発達の初期段階でのin vivoミクログリア活性化の研究と神経保護戦略のスクリーニングは、(1)離乳前の動物の脆弱性、および(2)ミクログリア細胞の数が少ないため、困難な場合があります。したがって、ミクログリアに関するin vitro研究は、毒性7、8、9、神経保護戦略5、10、11、12、13、14、および共培養15、16、17、18、19、20、21に広く使用されています。.インビトロ研究では、ミクログリア細胞株、幹細胞由来のミクログリア、または初代ミクログリア培養のいずれかを使用できます。これらすべてのアプローチには長所と短所があり、選択は最初の生物学的問題によって異なります。初代ミクログリア培養を使用する利点は、均質な遺伝的背景、病原体のない履歴、および動物の死後にミクログリアが刺激される時間の制御です22。

長年にわたり、新生児と成人の両方のげっ歯類から一次ミクログリアを培養するためのさまざまな方法(フローサイトメトリー、振とう、または磁気標識)が開発されました23、24、25、26、27、28、29。本研究では、マウス新生児仔からのミクログリア単離を、マイクロビーズコーティング抗マウスCD11b25,27,29を用いた既述の磁気活性化細胞選別技術を用いて行う。CD11bは、ミクログリアを含む骨髄系細胞の表面に発現するインテグリン受容体です。脳内に炎症性の問題がない場合、ほとんどすべてのCD11b +細胞はミクログリア30です。以前に発表された他の方法23、24、25、26、27、28、29と比較して、本プロトコルは、即時のex vivoミクログリア活性化分析および一般的なin vitro初代ミクログリア培養のバランスをとる。したがって、ミクログリアは、(1)ミエリン除去なしで(P)8生後日に単離され、(2)血清なしで培養され、(3)脳単離後わずか48時間でsiRNA、miRNA、薬理学的化合物、および/または炎症刺激のいずれかに曝露されます。これらの3つの側面のそれぞれは、現在のプロトコルを関連性があり迅速なものにします。まず第一に、小児ミクログリアの使用は、インビトロでミクログリア反応性を潜在的に改変する可能性のある追加の脱髄ステップを必要とせずに、培養中の動的で反応性の生存細胞を得ることを可能にする。本プロトコルは、ミクログリアの生理学的環境にできるだけ近づけることを目的とする。実際、ミクログリアは血清に遭遇することはなく、このプロトコルも血清の使用を必要としません。さらに、培養後48時間という早い時期にミクログリアを曝露することで、ミクログリアが生理学的能力を失うことを防ぎます。

Protocol

議定書が承認され、すべての動物は、フランス、インセルム国立サンテ・エ・ラ・レシェルシュ科学研究所の制度的ガイドラインに従って取り扱われました。P8での24匹のOF1マウス子犬(オスとメスの両方)の脳からのミクログリアの磁気分離は、6ウェル、12ウェル、または96ウェルプレートに分けて提示されます。実験作業は、無菌状態を維持するためにフードの下で行われた。 <p class="jove_…

Representative Results

ミクログリアはCNS常在マクロファージであり、環境問題(外傷、毒性分子、炎症)にさらされると活性化されます4、5、6、34(図3A)。ミクログリアに関するin vitro研究は、これらの環境課題に関連する細胞自律メカニズムを評価し、薬理学的または遺伝子操作後の活性化状…

Discussion

現在の研究では、磁気的に選別されたCD11b +細胞を使用した初代ミクログリア細胞培養を示しています。ミクログリア機能評価(RT-qPCRおよび食細胞アッセイ)に加えて、ミクログリア培養純度も決定しました。

古典的なミクログリア細胞培養は、通常、P1またはP2げっ歯類の新生児脳から生成され、星状細胞と少なくとも10日間共培養されます。次に、ミクログリアはオービ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

図はBioRenderを使用して作成されました。研究は、Inserm、パリ大学、Horizon 2020(PREMSTEM-874721)、Fondation de France、Fondation ARSEP、Fondation pour la Recherche sur le Cerveau、Fondation Grace de Monaco、およびInvestissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRISおよびInvestissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.E.からの追加助成金によって資金提供されています。

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Tags

MicrogliaMagnetic Cell SortingNeonate MousePrimary Cell CultureCD11bCell DissociationHBSSSorting BufferCell SeparationCell Count
check_url/62964?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image