JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Magnetisk isolering af mikroglialceller fra nyfødt mus til primære cellekulturer

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/62964
, , , , , , , , , ,
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48,Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care,APHP-Sorbonne university

Summary

Primære microglia-kulturer bruges almindeligvis til at evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar og relevant metode til magnetisk isolering af microglia fra nyfødte hvalpe.

Abstract

Microglia, som hjerneboende makrofager, er grundlæggende for flere funktioner, herunder respons på miljøstress og hjernehomeostase. Microglia kan vedtage et stort spektrum af aktiveringsfænotyper. Desuden er microglia, der støtter proinflammatorisk fænotype, forbundet med både neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative lidelser. In vitro-undersøgelser anvendes i vid udstrækning i forskning til at evaluere potentielle terapeutiske strategier i specifikke celletyper. I denne sammenhæng er det mere relevant at studere mikroglial aktivering og neuroinflammation in vitro ved hjælp af primære mikroglialkulturer end mikroglialcellelinjer eller stamcelleafledt microglia. Imidlertid kan brugen af nogle primære kulturer lide af manglende reproducerbarhed. Denne protokol foreslår en reproducerbar og relevant metode til magnetisk isolering af microglia fra nyfødte hvalpe. Mikroglial aktivering ved hjælp af flere stimuli efter 4 timer og 24 timer ved mRNA-ekspressionskvantificering og et Cy3-perle fagocytisk assay er demonstreret her. Det nuværende arbejde forventes at give en let reproducerbar teknik til isolering af fysiologisk relevant mikroglia fra ungdomsudviklingsstadier.

Introduction

Microglia er centralnervesystemet bosiddende makrofaglignende celler afledt af erythropoietiske forstadier af æggeblommesækken, der migrerer til neuroepitelet under tidlig embryonal udvikling1. Bortset fra deres immunitetsfunktioner spiller de også en væsentlig rolle under neuroudvikling, især for synaptogenese, neuronal homeostase og myelinering2. I voksenalderen udvikler microglia lange cellulære processer til at scanne miljøet kontinuerligt. I tilfælde af homeostasebrud som hjerneskade eller hjernesygdom kan microglia ændre deres morfologiske udseende for at vedtage en amoeboid form, migrere til det skadede område, øge og frigive mange cytoprotektive eller cytotoksiske faktorer. Microglia har heterogene aktiveringstilstande afhængigt af deres udviklingsstadium og typen af skade, der er pådraget 3,4,5. I denne undersøgelse er disse aktiveringstilstande bredt klassificeret i tre forskellige fænotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk og immunoregulerende, idet man husker på, at situationen i virkeligheden sandsynligvis vil være mere kompleks6.

At studere in vivo mikroglial aktivering og screening for neurobeskyttende strategier i tidlige stadier af hjernens udvikling kan være udfordrende på grund af (1) skrøbelighed hos dyr før fravænning og (2) det lave antal mikroglialceller. Derfor anvendes in vitro-undersøgelser af microglia i vid udstrækning for toksicitet 7,8,9, neurobeskyttende strategier5,10,11,12,13,14 og cokulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-undersøgelser kan anvende enten mikroglialcellelinjer, stamcelleafledt microglia eller primær microglia-kultur. Alle disse tilgange har fordele og ulemper, og valget afhænger af det oprindelige biologiske spørgsmål. Fordelene ved at bruge primære microglia-kulturer er den homogene genetiske baggrund, patogenfri historie og kontrol af det tidspunkt, hvor microglia stimuleres efter dyredød22.

I årenes løb blev der udviklet forskellige metoder (flowcytometri, rystelser eller magnetisk mærkning) til dyrkning af primær mikroglia fra gnavere, både nyfødte og voksne 23,24,25,26,27,28,29. I det foreliggende arbejde udføres mikroglia-isolering fra musenyfødte hvalpe ved hjælp af tidligere beskrevet magnetisk aktiveret cellesorteringsteknologi ved hjælp af mikroperlebelagt anti-mus CD11b25,27,29. CD11b er en integrinreceptor udtrykt på overfladen af myeloide celler, herunder microglia. Når der ikke er nogen inflammatorisk udfordring i hjernen, er næsten alle CD11b + celler microglia30. Sammenlignet med andre tidligere offentliggjorte metoder 23,24,25,26,27,28,29 balancerer den nuværende protokol øjeblikkelige ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser og almindelig in vitro primær mikroglialkultur. Således isoleres microglia (1) ved postnatal dag (P)8 uden myelinfjernelse, (2) dyrkes uden serum og (3) udsættes enten for siRNA, miRNA, farmakologisk forbindelse og / eller inflammatoriske stimuli kun 48 timer efter hjerneisolering. Hvert af disse tre aspekter gør den nuværende protokol relevant og hurtig. Først og fremmest tillader brugen af pædiatrisk microglia at opnå dynamiske og reaktive levedygtige celler i kultur uden at kræve et yderligere demyeliniseringstrin, der potentielt kan ændre mikroglial reaktivitet in vitro. Den nuværende protokol sigter mod at komme så tæt som muligt på det fysiologiske miljø i microglia. Faktisk støder microglia aldrig på serum, og denne protokol kræver heller ikke brug af serum. Desuden forhindrer eksponering af microglia så tidligt som 48 timer efter kultur dem i at miste deres fysiologiske evner.

Protocol

Protokollen blev godkendt, og alle dyrene blev håndteret i henhold til de institutionelle retningslinjer fra Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrig). Magnetisk isolering af microglia fra hjernen hos 24 OF1 museunger (både mandlige og kvindelige) ved P8, opdelt i 6-brønd, 12-brønd eller 96-brøndplader, præsenteres. Det eksperimentelle arbejde blev udført under en hætte for at opretholde sterile forhold. 1. Fremstilling af sterile opløsnin…

Representative Results

Microglia er den CNS-residente makrofag, der aktiveres, når den udsættes for miljømæssige udfordringer (traumer, giftige molekyler, betændelse)4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-undersøgelser af microglia anvendes almindeligvis til at evaluere celleautonome mekanismer relateret til disse miljømæssige udfordringer og karakterisere aktiveringstilstand eft…

Discussion

Det nuværende arbejde præsenterer en primær mikroglialcellekultur ved hjælp af magnetisk sorterede CD11b + celler. Ud over den mikrogliale funktionelle evaluering (RT-qPCR og fagocytiske assays) blev mikroglialkulturens renhed også bestemt.

Klassiske microgliacellekulturer genereres almindeligvis fra P1- eller P2-gnavernyfødt hjerne og samkultur med astrocytter i mindst 10 dage. Microglia adskilles derefter mekanisk ved hjælp af en orbital shaker. Metoden til at isolere og dyrke microgl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tallene er skabt ved hjælp af BioRender. Forskningen er finansieret af Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, og et yderligere tilskud fra Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS og Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Tags

MicrogliaMagnetic Cell SortingNeonate MousePrimary Cell CultureCD11bCell DissociationHBSSSorting BufferCell SeparationCell Count
check_url/62964?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image