साइटोकाइन-विभेदित मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की वास्तविक समय की निगरानी
Summary
चयापचय अनुकूलन टी कोशिकाओं के लिए मौलिक है क्योंकि यह भेदभाव, दृढ़ता और साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करता है। यहां, पूर्व विवो साइटोकाइन-विभेदित मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की निगरानी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
सक्रियण के दौरान, टी कोशिकाओं का चयापचय उन परिवर्तनों के अनुकूल होता है जो उनके भाग्य को प्रभावित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि टी सेल सक्रियण के लिए अपरिहार्य है, और स्मृति टी कोशिकाओं का अस्तित्व माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडलिंग पर निर्भर करता है। नतीजतन, यह कैंसर इम्यूनोथेरेपी के दीर्घकालिक नैदानिक परिणाम को प्रभावित करता है। टी सेल की गुणवत्ता में परिवर्तन अक्सर अच्छी तरह से ज्ञात सतह मार्करों का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अध्ययन किया जाता है और सीधे उनके चयापचय राज्य द्वारा नहीं। यह एक एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक और साइटोकिन्स आईएल -2 और आईएल -15 का उपयोग करके प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के वास्तविक समय माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, जो टी सेल चयापचय को अलग-अलग प्रभावित करता है। यह दिखाया गया है कि टी कोशिकाओं की चयापचय स्थिति को स्पष्ट रूप से चयापचय मार्ग में प्रमुख परिसरों को बाधित करते समय ऑक्सीजन की खपत को मापकर प्रतिष्ठित किया जा सकता है और इन मापों की सटीकता इष्टतम अवरोधक एकाग्रता और अवरोधक इंजेक्शन रणनीति पर अत्यधिक निर्भर है। यह मानकीकृत प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कैंसर इम्यूनोथेरेपी की निगरानी और अध्ययन में टी सेल फिटनेस के लिए एक मानक के रूप में लागू करने में मदद करेगा।
Introduction
एंटीजन को पहचानने और प्रतिक्रिया देने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता के लिए सही टी सेल विकास और कार्य आवश्यक हैं। माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ऑक्सफॉस) टी सेल की स्थिति के अनुसार बदलता है। भोले टी कोशिकाएं मुख्य रूप से एटीपी का उत्पादन करने के लिए ऑक्सफॉस का उपयोग करती हैं, जबकि सक्रिय टी कोशिकाएं एक चयापचय संक्रमण से गुजरती हैं जहां ग्लाइकोलाइसिस प्रमुख हो जाता है। प्रभावक चरण के बाद, स्मृति टी कोशिकाओं का छोटा शेष सबसेट ऑक्सफॉस 2, 3 के प्रभुत्व वाले चयापचय राज्य में वापस आ जाता है। OxPhos के परिवर्तन टी कोशिकाओं के विभेदन का इस तरह से पालन करते हैं कि टी कोशिकाओं के सबसेट को भी उनके विशिष्ट द्वारा विभेदित किया जा सकता है OxPhos गुण 1। इसके विपरीत, OxPhos टी कोशिकाओं के कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, और OxPhos के निषेध को टी कोशिकाओं के प्रसार और साइटोकाइन उत्पादन को अवरुद्ध करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसलिए, एक सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से टी सेल ऑक्सफॉस के गुणों को मापने की क्षमता टी कोशिकाओं के साथ काम करने वाले किसी भी व्यक्ति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
इस प्रोटोकॉल में, टी सेल ऑक्सफॉस के गुणों को एक एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके मापा जाता है। इस विश्लेषक का मुख्य कार्य विश्लेषण किए जाने वाले कोशिकाओं के विकास मीडिया की ऑक्सीजन सामग्री को लगातार मापना है। विकास मीडिया से हटाई गई ऑक्सीजन को कोशिकाओं द्वारा लिया जाना माना जाता है। विभिन्न प्रकार के ऑक्सफॉस अवरोधकों या संशोधक के साथ कोशिकाओं का इलाज करके, ऑक्सीजन अपटेक में एक बूंद बाधित या मॉडुलित फ़ंक्शन से जुड़ी होती है। उदाहरण के लिए, एटीपी सिंथेज़ के निषेध से ऑक्सीजन का एक कम सेलुलर अपटेक होगा जिसका उपयोग अन्यथा ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा एटीपी का उत्पादन करने के लिए किया जाएगा। क्लार्क इलेक्ट्रोड और ओरोबोरोस उपकरण सहित अन्य उपकरण, समान कार्यक्षमता प्रदान करते हैं, और प्रत्येक उपकरण के अलग-अलग फायदे और कमियां हैं। इन उपकरणों में अध्ययन के लिए सेल प्रकारों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण सेल प्रकार मानव प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स 5 है। उनके छोटे आकार, खराब उत्तरजीविता पूर्व विवो, और गैर-अनुयायी गुणों के कारण, मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
यह एक बाह्य कोशिकीय विश्लेषक द्वारा मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रोटोकॉल को एक अनुकूलन रन में विभाजित किया गया है, जहां सेल संख्या की इष्टतम सांद्रता प्रति अच्छी तरह से, साथ ही साथ ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी की इष्टतम एकाग्रता भी निर्धारित की जाती है। इसके अलावा, एक परख चलाने, जहां अनुकूलित शर्तों का उपयोग किया जाता है.
रक्त-व्युत्पन्न मानव PBMCs और पूर्व विवो प्राथमिक टी सेल संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, यह प्रोटोकॉल इष्टतम अवरोधक एकाग्रता के महत्व और संवेदनशील सेल प्रकारों के साथ काम करते समय माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन के बजाय अलग-अलग उपयोग करने की प्रासंगिकता को दर्शाता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया जाता है कि यह परख साइटोकिन्स आईएल -2 और आईएल -15 के साथ ध्रुवीकरण पर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में सूक्ष्म अंतर का मजबूती से पता लगा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का विस्तृत और सही परिमाणीकरण टी कोशिकाओं की ऊर्जा राज्यों का वर्णन करते समय एक अपरिहार्य उपकरण है। माइटोकॉन्ड्रियल फिटनेस की स्थिति सीधे टी सेल सक्रियण क्षमता, अस्तित्व और…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard और ऐनी Rahbech Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat से अनुदान प्राप्त किया। Kasper Mølgaardals भी Børnecancerfonden से अनुदान प्राप्त किया।
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
