Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени
Summary
Метаболическая адаптация имеет основополагающее значение для Т-клеток, поскольку она диктует дифференцировку, персистенцию и цитотоксичность. Здесь представлен оптимизированный протокол мониторинга митохондриального дыхания в ex vivo цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека.
Abstract
Во время активации метаболизм Т-клеток приспосабливается к изменениям, которые влияют на их судьбу. Увеличение митохондриального окислительного фосфорилирования необходимо для активации Т-клеток, а выживание Т-клеток памяти зависит от ремоделирования митохондрий. Следовательно, это влияет на долгосрочный клинический исход иммунотерапии рака. Изменения качества Т-клеток часто изучаются с помощью проточной цитометрии с использованием хорошо известных поверхностных маркеров, а не непосредственно их метаболического состояния. Это оптимизированный протокол для измерения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека в режиме реального времени с использованием анализатора внеклеточного потока и цитокинов IL-2 и IL-15, которые по-разному влияют на метаболизм Т-клеток. Показано, что метаболическое состояние Т-клеток можно четко различить путем измерения потребления кислорода при ингибировании ключевых комплексов в метаболическом пути и что точность этих измерений сильно зависит от оптимальной концентрации ингибитора и стратегии инъекции ингибитора. Этот стандартизированный протокол поможет внедрить митохондриальное дыхание в качестве стандарта для пригодности Т-клеток при мониторинге и изучении иммунотерапии рака.
Introduction
Правильное развитие и функционирование Т-клеток необходимы для способности иммунной системы распознавать и реагировать на антигены. Митохондриальное окислительное фосфорилирование (OxPhos) изменяется в зависимости от состояния Т-клетки. Наивные Т-клетки преимущественно используют OxPhos для производства АТФ, тогда как активированные Т-клетки подвергаются метаболическому переходу, когда гликолиз становится доминирующим1. После эффекторной фазы небольшое оставшееся подмножество Т-клеток памяти возвращается к метаболическому состоянию, в котором доминирует OxPhos2,3. Изменения OxPhos следуют за дифференцировкой Т-клеток до такой степени, что даже подмножества Т-клеток могут быть дифференцированы по их специфическим свойствам OxPhos1. И наоборот, OxPhos важен для функции Т-клеток, и было продемонстрировано, что ингибирование OxPhos блокирует пролиферацию и выработку цитокинов Т-клеток4. Таким образом, способность количественно оценивать свойства Т-клеток OxPhos точным и воспроизводимым образом является мощным инструментом для всех, кто работает с Т-клетками.
В этом протоколе свойства Т-клеток OxPhos измеряются с помощью внеклеточного анализатора потока. Основная функция этого анализатора заключается в непрерывном измерении содержания кислорода в питательных средах анализируемых клеток. Предполагается, что кислород, удаленный из среды роста, поглощается клетками. При обработке клеток различными ингибиторами или модификаторами OxPhos падение поглощения кислорода связано с ингибированной или модулированной функцией. Например, ингибирование АТФ-синтазы приведет к снижению клеточного поглощения кислорода, который в противном случае использовался бы для производства АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другое оборудование, включая электрод Кларка и инструмент Oroboros, предлагает аналогичную функциональность, и каждый инструмент имеет разные преимущества и недостатки. Широкий спектр типов клеток может быть использован для исследований в этих устройствах, но одним из особенно сложных типов клеток являются первичные Т-лимфоциты человека5. Из-за их небольшого размера, плохой выживаемости ex vivo и неадгезивных свойств первичные Т-клетки человека могут быть сложными для изучения.
Это протокол для изучения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека с помощью внеклеточного анализатора. Протокол разделен на оптимизационный прогон, где определяются оптимальные концентрации клеточного числа на лунку, а также оптимальная концентрация олигомицина и FCCP. Кроме того, проводится анализ, в котором используются оптимизированные условия.
Используя полученные из крови человеческие PBMCs и ex vivo первичные Т-клеточные культуры, этот протокол демонстрирует важность оптимальной концентрации ингибиторов и актуальность использования отдельных вместо последовательной инъекции митохондриальных ингибиторов при работе с чувствительными типами клеток. Наконец, показано, что этот анализ может надежно обнаруживать тонкие различия в митохондриальном дыхании при поляризации цитокинами IL-2 и IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Детальная и правильная количественная оценка окислительного фосфорилирования является незаменимым инструментом при описании энергетических состояний Т-клеток. Состояние митохондриальной приспособленности может быть напрямую связано с потенциалом активации Т-клеток, выживаемость…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Каспер Мёльгаард и Анне Рахбех получили гранты от Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Каспер Мёльгаард также получил грант от Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
