Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen
Summary
Die metabolische Anpassung ist für T-Zellen von grundlegender Bedeutung, da sie Differenzierung, Persistenz und Zytotoxizität bestimmt. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der mitochondrialen Atmung in ex vivo Zytokin-differenzierten humanen primären T-Zellen vorgestellt.
Abstract
Während der Aktivierung passt sich der Stoffwechsel von T-Zellen an Veränderungen an, die sich auf ihr Schicksal auswirken. Eine Erhöhung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung ist für die T-Zell-Aktivierung unerlässlich, und das Überleben von Gedächtnis-T-Zellen hängt vom mitochondrialen Umbau ab. Folglich beeinflusst dies das langfristige klinische Ergebnis von Krebsimmuntherapien. Veränderungen der T-Zell-Qualität werden oft durch Durchflusszytometrie unter Verwendung bekannter Oberflächenmarker und nicht direkt durch ihren Stoffwechselzustand untersucht. Dies ist ein optimiertes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Atmung primärer menschlicher T-Zellen in Echtzeit mit einem extrazellulären Flussanalysator und den Zytokinen IL-2 und IL-15, die den T-Zell-Stoffwechsel unterschiedlich beeinflussen. Es wird gezeigt, dass der Stoffwechselzustand von T-Zellen durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs bei der Hemmung von Schlüsselkomplexen im Stoffwechselweg eindeutig unterschieden werden kann und dass die Genauigkeit dieser Messungen in hohem Maße von der optimalen Inhibitorkonzentration und der Inhibitorinjektionsstrategie abhängt. Dieses standardisierte Protokoll wird dazu beitragen, die mitochondriale Atmung als Standard für die T-Zell-Fitness bei der Überwachung und Untersuchung von Krebsimmuntherapien zu implementieren.
Introduction
Die korrekte Entwicklung und Funktion von T-Zellen ist für die Fähigkeit des Immunsystems, Antigene zu erkennen und darauf zu reagieren, unerlässlich. Die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OxPhos) ändert sich je nach Zustand der T-Zelle. Naive T-Zellen verwenden OxPhos überwiegend zur Produktion von ATP, während aktivierte T-Zellen einen metabolischen Übergang durchlaufen, bei dem die Glykolyse dominant wird1. Nach der Effektorphase kehrt die kleine verbleibende Teilmenge der Gedächtnis-T-Zellen in einen von OxPhos2,3 dominierten Stoffwechselzustand zurück. Die Veränderungen von OxPhos folgen der Differenzierung von T-Zellen in einem solchen Maße, dass auch Teilmengen von T-Zellen durch ihre spezifischen OxPhos-Eigenschaften unterschieden werden können1. Umgekehrt ist OxPhos wichtig für die Funktion von T-Zellen, und die Hemmung von OxPhos blockiert nachweislich die Proliferation und Zytokinproduktion von T-Zellen4. Daher ist die Fähigkeit, die Eigenschaften von T-Zell-OxPhos präzise und reproduzierbar zu quantifizieren, ein leistungsfähiges Werkzeug für jeden, der mit T-Zellen arbeitet.
In diesem Protokoll werden die Eigenschaften von T-Zell-OxPhos mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Die Kernfunktion dieses Analysators besteht darin, kontinuierlich den Sauerstoffgehalt der Wachstumsmedien der zu analysierenden Zellen zu messen. Es wird angenommen, dass Sauerstoff, der aus den Wachstumsmedien entfernt wird, von den Zellen aufgenommen wird. Durch die Behandlung der Zellen mit einer Vielzahl von Oxphos-Inhibitoren oder Modifikatoren ist ein Abfall der Sauerstoffaufnahme mit der gehemmten oder modulierten Funktion verbunden. Zum Beispiel führt die Hemmung der ATP-Synthase zu einer reduzierten zellulären Aufnahme von Sauerstoff, der sonst zur Herstellung von ATP durch oxidative Phosphorylierung verwendet würde. Andere Geräte, einschließlich der Clark-Elektrode und des Oroboros-Instruments, bieten eine ähnliche Funktionalität, und jedes Instrument hat unterschiedliche Vorteile und Mängel. Eine breite Palette von Zelltypen kann für Studien in diesen Geräten verwendet werden, aber ein besonders herausfordernder Zelltyp sind menschliche primäre T-Lymphozyten5. Aufgrund ihrer geringen Größe, ihres schlechten Ex-vivo-Überlebens und ihrer nicht adhärenten Eigenschaften können menschliche primäre T-Zellen schwierig zu untersuchen sein.
Dies ist ein Protokoll zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung menschlicher primärer T-Zellen durch einen extrazellulären Analysator. Das Protokoll ist in einen Optimierungslauf unterteilt, bei dem optimale Konzentrationen der Zellzahl pro Well, sowie die optimale Konzentration von Oligomycin und FCCP, bestimmt werden. Weiterhin ein Assay-Lauf, bei dem die optimierten Bedingungen genutzt werden.
Unter Verwendung von aus Blut gewonnenen humanen PBMCs und ex vivo primären T-Zellkulturen zeigt dieses Protokoll die Bedeutung einer optimalen Inhibitorkonzentration und die Relevanz der Verwendung separater anstelle einer sequentiellen Injektion von mitochondrialen Inhibitoren bei der Arbeit mit empfindlichen Zelltypen. Schließlich wird gezeigt, dass dieser Assay subtile Unterschiede in der mitochondrialen Atmung bei Polarisation mit den Zytokinen IL-2 und IL-15 robust nachweisen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine detaillierte und korrekte Quantifizierung der oxidativen Phosphorylierung ist ein unverzichtbares Werkzeug bei der Beschreibung der Energiezustände von T-Zellen. Der Zustand der mitochondrialen Fitness kann in direktem Zusammenhang mit dem T-Zell-Aktivierungspotenzial, dem Überleben und der Differenzierung stehen1,5. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die verschiedenen Eigenschaften der oxidativen Phosphorylierung zu bestimmen (siehe Tabelle 4</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard und Anne Rahbech erhielten Stipendien von Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard erhielt auch ein Stipendium von Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
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