Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Summary

Het doel van dit protocol is om celadhesie en -groei te richten op gerichte gebieden van rasters voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door een aangroeiwerende laag aan te brengen die wordt opgeblazen in door de gebruiker gespecificeerde patronen, gevolgd door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in de patroongebieden voorafgaand aan het zaaien van cellen.

Abstract

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is een krachtige technologie die wordt gebruikt om resolutiestructuren op nanometerniveau te produceren van macromoleculen die aanwezig zijn in de cellulaire context en bewaard blijven in een bijna inheemse bevroren gehydrateerde toestand. Er zijn echter uitdagingen verbonden aan het kweken en / of hechten van cellen op TEM-rasters op een manier die geschikt is voor tomografie met behoud van de cellen in hun fysiologische toestand. Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol gepresenteerd over het gebruik van micropatterning om eukaryote celgroei op TEM-rasters te sturen en te bevorderen. Tijdens micropatterning wordt de celgroei gestuurd door extracellulaire matrix (ECM) eiwitten af te zetten binnen gespecificeerde patronen en posities op de folie van het TEM-raster, terwijl de andere gebieden bedekt blijven met een aangroeiwerende laag. Flexibiliteit in de keuze van oppervlaktecoating en patroonontwerp maakt micropatterning breed toepasbaar voor een breed scala aan celtypen. Micropatterning is nuttig voor studies van structuren in individuele cellen, evenals meer complexe experimentele systemen zoals gastheer-pathogeen interacties of gedifferentieerde multicellulaire gemeenschappen. Micropatterning kan ook worden geïntegreerd in veel downstream cryo-ET-workflows voor hele cellen, waaronder correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (cryo-CLEM) en focused-ion beam milling (cryo-FIB).

Introduction

Met de ontwikkeling, uitbreiding en veelzijdigheid van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) hebben onderzoekers een breed scala aan biologische monsters onderzocht in een bijna-inheemse toestand van macromoleculaire (~ 1 nm) tot hoge (~ 2 Å) resolutie. Cryo-EM- en elektronendiffractietechnieken met één deeltje kunnen het beste worden toegepast op gezuiverde macromoleculen in oplossing of in kristallijne toestand, ^{respectievelijk1,2}. Terwijl cryo-elektronentomografie (cryo-ET) bij uitstek geschikt is voor near-native structurele en ultrastructurele studies van grote, heterologe objecten zoals bacteriën, pleomorfe virussen en eukaryote ^cellen3. In cryo-ET wordt driedimensionale (3D) informatie verkregen door het monster fysiek op het microscoopstadium te kantelen en een reeks beelden onder verschillende hoeken door het monster te verkrijgen. Deze beelden, of tilt-series, bestrijken vaak een bereik van +60/-60 graden in stappen van één tot drie graden. De tilt-serie kan vervolgens computationeel worden gereconstrueerd tot een 3D-volume, ook wel ^{tomogram4 genoemd}.

Alle cryo-EM-technieken vereisen dat het monster wordt ingebed in een dunne laag amorf, niet-kristallijn glasachtig ijs. Een van de meest gebruikte cryofixatietechnieken is plunge freezing, waarbij het monster op het EM-rooster wordt aangebracht, uitgeveegd en snel wordt ondergedompeld in vloeibaar ethaan of een mengsel van vloeibaar ethaan en propaan. Deze techniek is voldoende voor de vitrificatie van monsters van <100 nm tot ~10 μm dik, inclusief gekweekte menselijke cellen, zoals HeLa-cellen5,6. Dikkere monsters, zoals mini-organoïden of weefselbiopten, tot 200 μm dik, kunnen worden verglaasd door hogedrukbevriezing7. Vanwege de toegenomen elektronenverstrooiing van dikkere monsters is de monster- en ijsdikte voor cryo-ET echter beperkt tot ~ 0,5 – 1 μm in 300 kV transmissie-elektronenmicroscopen. Daarom is cryo-ET voor hele cellen van veel eukaryote cellen beperkt tot de celrand of uitbreidingen van cellen, tenzij aanvullende monstervoorbereidingsstappen worden gebruikt, zoals cryo-sectioning8 of focused-ion beam milling9,10,11.

Een beperking van veel cryo-ET-beeldvormingsexperimenten met hele cellen is de doorvoersnelheid van ^{gegevensverzameling12}. In tegenstelling tot cryo-EM met één deeltje, waar duizenden geïsoleerde deeltjes vaak kunnen worden afgebeeld vanuit een enkel TEM-rastervierkant, zijn cellen groot, verspreid en moeten ze met een voldoende lage dichtheid worden gekweekt om de cellen te kunnen bewaren in een dunne laag glasachtig ijs. Vaak is het gebied van belang beperkt tot een bepaald kenmerk of deelgebied van de cel. Verdere beperking van de doorvoer is de neiging van cellen om te groeien op gebieden die niet vatbaar zijn voor TEM-beeldvorming, zoals op of in de buurt van TEM-rasterbalken. Vanwege onvoorspelbare factoren die verband houden met celcultuur op TEM-rasters, zijn technologische ontwikkelingen nodig om de toegankelijkheid en doorvoer van monsters voor gegevensverzameling te verbeteren.

Substraatmicropatterning met aanhangende extracellulaire matrix (ECM) eiwitten is een gevestigde techniek voor live-cell lichtmicroscopie om de groei van cellen op stijve, duurzame en optisch transparante oppervlakken zoals glas en andere weefselkweeksubstraten ^{te sturen13,14}. Micropatterning is ook uitgevoerd op zachte en/of driedimensionale (3D) oppervlakken. Dergelijke technieken hebben niet alleen de precieze positionering van cellen mogelijk gemaakt; ze hebben ook de creatie van meercellige netwerken ondersteund, zoals patroonvormige neurale ^{celcircuits15}. Het brengen van micropatterning naar cryo-ET zal niet alleen de doorvoer verhogen, maar het kan ook nieuwe studies openen voor het verkennen van complexe en dynamische cellulaire micro-omgevingen.

Onlangs zijn verschillende groepen begonnen met het gebruik van micropatterningtechnieken op TEM-rasters via meerdere ^{benaderingen16,17}. Hier wordt het gebruik van een maskerloze fotopatterningtechniek voor TEM-rasters beschreven met behulp van het Alvéole PRIMO-micropatterningsysteem, dat beschikt over hoge resolutie en contactloze patronen. Met dit micropatterningsysteem wordt een aangroeiwerende laag aangebracht op de bovenkant van het substraat, gevolgd door het aanbrengen van een fotokatalysator en ablatie van de aangroeiwerende laag in door de gebruiker gedefinieerde patronen met een UV-laser. ECM-eiwitten kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de patronen voor de juiste celkweek. Deze methode is door verschillende groepen gebruikt voor cryo-ET-studies van retinale pigmentepitheel-1 (RPE1), Madin-Darby canine kidney-II (MDCKII), humane voorhuidfibroblast (HFF) en endotheelcellijnen16,17,18. Dit micropatterningsysteem is compatibel met meerdere aangroeiwerende laagsubstraten en met een vloeibaar of gelfotokatalysatorreagens. Een verscheidenheid aan ECM-eiwitten kan worden geselecteerd uit en aangepast aan de specificiteit van de cellijn, waardoor veelzijdigheid voor de gebruiker wordt verleend.

Micropatterning is succesvol toegepast op een aantal projecten binnen het ^{laboratorium19}. Hier wordt een micropatterningprotocol gepresenteerd, inclusief specifieke aanpassingen om gekweekte HeLa-cellen, respiratoir syncytieel virus (RSV)-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen en primaire larvale Drosophila melanogaster-neuronen20 te bestuderen.

Protocol

Het protocol dat hier wordt beschreven, is een compilatie van de celkweek,micropatterning en beeldvormingsmethoden die worden gebruikt door het Wright-laboratorium en het Cryo-EM Research Center aan de Universiteit van Wisconsin, Madison. De workflow is weergegeven in figuur 1. Aanvullend trainings- en instructiemateriaal is beschikbaar op de volgende locaties: https://cryoem.wisc.edu of https://wrightlab.wisc.edu 1. Voorbereiding van rasters voor patroonvorming Breng de TEM-roosters over op een schone glasplaat, koolstofzijde naar boven (de standaarddikte van de koolstoffolie is 12 nm). Met behulp van een koolstofverdamper, ACE600, verdampt 5-8 nm extra koolstof op de roosters om de algehele duurzaamheid van koolstoffilms te vergroten.OPMERKING: Deze stap is niet nodig voor SiO2-roosters . Deze stap kan ook van tevoren worden gedaan; bewaar de gecoate roosters in een omgeving met een lage luchtvochtigheid, zoals een vacuümsiccator. Breng de roosters over naar een roostervoorbereidingshouder en gloei de koolstof van de roosters naar boven. Met behulp van een gloedafvoersysteem ontlaadt u de roosters gedurende 60 s bij 10 mA met een werkafstand van 80 mm en vacuümdruk van 1,0 x 10-3 mbar. Doe dit binnen 15-30 minuten na de volgende stap.OPMERKING: Roostervoorbereidingshouders kunnen commercieel worden gekocht of zelfgemaakt met een stuk filterpapier op een klein petrischaaltje. 2. Aanbrengen van de aangroeiwerende laag OPMERKING: De juiste steriele techniek moet worden gebruikt bij het hanteren van de roosters en alle oplossingen moeten steriel zijn en / of filtersteriliseren. Breng de roosters (koolstofzijde naar boven) over op een schone glazen schuif of afdekplaat met ten minste 1 cm scheiding tussen de roosters. Pipetteer 10 μL van 0,05% poly-L-lysine (PLL) op elk rooster. Incubeer de roosters in een vochtige kamer, zoals een afgesloten plastic doos met vochtige papieren handdoeken, gedurende ten minste 30 minuten.OPMERKING: Deze stap kan worden verlengd tot ‘s nachts. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de kamer voldoende is om te voorkomen dat de roosters uitdrogen. Was elk rooster driemaal met 15 μL van 0,1 M HEPES pH 8,5. Verwijder voor elke wasbeurt het grootste deel van de vloeistof van het rooster met een pipet zonder het rooster te laten drogen. Voeg 15 μL verse buffer toe, incubeer gedurende ten minste 30 s en herhaal. Laat elk rooster na de laatste wasbeurt in 15 μL van 0,1 M HEPES staan.OPMERKING: In deze stap en toekomstige stappen is het belangrijk om het rooster nat te houden en contact tussen de pipet en het rooster te vermijden. Bereid 10 μL van 100 mg / ml polyethyleenglycol-succinimidylvalraat (PEG-SVA) in 0,1 M HEPES pH 8,5 voor elk rooster. De PEG-SVA lost snel op met voorzichtig mengen wat resulteert in een heldere oplossing.OPMERKING: Bereid de PEG-SVA-oplossing niet van tevoren voor. PEG-SVA heeft een halfwaardetijd van 10 min bij pH 8,5. Vermijd blootstelling van de PEG-SVA-voorraad aan overmatig vocht door deze op te slaan in een exsiccator of droge omgeving bij -20 °C en op te warmen tot kamertemperatuur voordat deze wordt geopend. Verwijder onmiddellijk na het bereiden van de PEG-SVA-oplossing de druppel van 15 μL HEPES pH 8,5 van elk rooster (let op dat het rooster niet droogt) en voeg een druppel van 10 μL van de PEG-SVA-oplossing toe. Incubeer de roosters in een vochtige kamer gedurende ten minste 1 uur.OPMERKING: Deze stap kan worden verlengd tot ‘s nachts. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de kamer voldoende is om te voorkomen dat de roosters uitdrogen. Was elk rooster driemaal met 15 μL steriel water. Verwijder voor elke wasbeurt het grootste deel van de vloeistof van het rooster met een pipet zonder het rooster te laten drogen, voeg 15 μL vers water toe, incubeer gedurende ten minste 30 s en herhaal dit. Laat elk rooster na de laatste wasbeurt in 15 μL water staan. 3. PLPP-gel aanbrengen Bereid een schone microscoopdeksel voor elk raster voor. Voer de volgende stappen uit voor elk raster, één raster tegelijk, om de kans op uitdroging van het rooster te minimaliseren. Plaats een druppel water van 1,0 μL op het midden van de coverslip om te helpen bij het plaatsen van het rooster op de coverslip en het nat houden van het rooster. Breng het rooster voorzichtig over van de waterdruppel van 15 μL naar de waterdruppel van 1,0 μL op de afdekplaat. Zorg ervoor dat u de koolstofkant van het rooster naar boven plaatst. Plaats voorzichtig een polydimethylsiloxaan (PDMS) stencil over het rooster, zorg ervoor dat het rooster gecentreerd blijft en dat het stencilcontact met de koolstoffolie van het rooster tot een minimum wordt beperkt. Voeg 1,0 μL 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchloride (PLPP) gel toe aan het rooster. Pipetteer voorzichtig om te mengen (raak het rooster niet aan met de pipetpunt). Verplaats de coverslip met het rooster naar een donkere locatie om te drogen. De gel droogt in ongeveer 15-30 min. 4. Kalibratie en ontwerp van het micropatroon Kleur één kant van een glazen afdekplaat met een highlighter. Voeg zwarte lijnen toe vanaf een permanente markering met fijne punt om het scherpstellen te vergemakkelijken. Plaats de coverslip op de microscoop zodat de gekleurde kant naar de objectieflens is gericht. Gebruik de brightfield-modus om scherp te stellen op de highlighter. Zorg ervoor dat de microscoop en het micropatterningsysteem zijn ingeschakeld en dat het juiste lichtpad is ingesteld. Open Micromanager en de Leonardo-software (Plugins > Leonardo) op de microscoopcomputer. Selecteer Kalibreren en volg de instructies op het scherm. Pas de scherpstelling van de microscoop aan zodat het beeld dat op de dia wordt geprojecteerd, scherp is. De blootstellingstijd moet mogelijk worden verkort. Selecteer na de kalibratie de optie Nu patroon. Noteer de micrometer/pixel (μm/px) verhouding gerapporteerd onder kalibratiegegevens in het venster linksboven van het programma (Figuur 2, gebied 1). Gebruik deze verhouding om het aantal pixels te bepalen dat per micrometer moet worden gebruikt bij het ontwerpen van een patroon. Controleer na kalibratie of de software nu open is met een live brightfield-weergave vanuit de microscoop. Plaats een voorbereid raster op een coverslip (sectie 3) op het podium met het raster naar de objectieflens gericht. Plaats het podium en pas de focus aan zodat het raster zichtbaar is in het softwarevenster. Meet de grootte van de rastervierkanten en rasterbalken in micrometers. De software bevat een liniaal die wordt geactiveerd door de knop in de linkerbenedenhoek om het raster te meten (figuur 2, gebied 2). De patronen die hier worden gebruikt voor een raster van 200 mazen komen bijvoorbeeld overeen met ~ 87 × rastervierkanten van 87 μm en rasterstaven van ~ 36 μm.OPMERKING: De software biedt flexibiliteit bij het wijzigen van patronen tijdens het wijzigen van patronen, zodat kleine onnauwkeurigheden in de meting kunnen worden getolereerd. Maak op basis van de bovenstaande metingen en verhoudingen patroon (en) met software voor het maken van afbeeldingen. De minimale objectgrootte met een objectief van 20× is 1,2 μm. Patronen moeten worden opgeslagen als ongecomprimeerde 8-bits .tiff bestanden. Zorg ervoor dat de software afbeeldingen niet opnieuw schaalt naar een andere pixelgrootte bij het opslaan. Het patroon moet passen in een vak van 800 × 800 pixels, voldoende om vier rastervierkanten te bedekken.OPMERKING: Pixels met een waarde van 255 (wit) worden met de hoogste intensiteit (totale dosis van de laser) weergegeven en pixels met een waarde van nul (zwart) hebben geen patroon. Alle pixels met een tussenwaarde worden gemodelleerd met een dosis van ongeveer (X/255)*totale dosis. In figuur 3A zijn pixelwaarden van 255 en 129 gebruikt voor de grijswaardenpatronen. Zodra het patroon is ontworpen, kan het zonder wijzigingen worden opgeslagen en hergebruikt. 5. Micropatterning Controleer na kalibratie of de software nu open is met een live brightfield-weergave vanuit de microscoop. Plaats een voorbereid raster op een coverslip (sectie 3) op het podium met het raster naar de objectieflens gericht. Plaats het podium en pas de focus aan om het raster in de software te zien. Voor een eerste uitvoering ontwerpt u een nieuwe sjabloon. Selecteer in de software ROI toevoegen (niet weergegeven, op de locatie van figuur 2 gebied 3) en kies een cirkel van 3.000 μm. Plaats de ROI van de cirkel over het raster met behulp van de brightfield-afbeelding op het scherm als leidraad. Druk op vergrendeling om de ROI te beveiligen. Nadat u de ROI op zijn plaats hebt vergrendeld, selecteert u Patroon toevoegen (niet weergegeven, op de locatie van figuur 2 gebied 3). Kies het patroon dat is ontworpen in sectie 4. Verdeel het raster in zes regio’s om onafhankelijke scherpstelling en positionering in elke regio mogelijk te maken om rekening te houden met ongelijke rasters. Een vierkant gebied van 8 × 8 rasters voor elke hoek van het raster en een vierkant gebied van 2 × 8 rasters aan elke kant van het midden, waardoor het midden vier rastervierkanten ongepatterd blijft (figuur 2, middelste afbeelding). Gebruik de replicatieopties (afbeelding 2, gebied 4) om kopieën van het oorspronkelijke patroon te genereren om het gewenste aantal totale kopieën van het patroon te bereiken. Pas indien nodig de afstand tussen kopieën aan de afstand tussen rastervierkanten aan. Stel de totale dosis voor het patroon in. 30 mJ/mm2 is een goed uitgangspunt. Zie het discussiegedeelte voor meer informatie. Stel onder Expertopties (afbeelding 2, gebied 4) de hoek van het gebied in op die van de rastervierkanten. Gebieden kunnen met de muis worden verplaatst. Ook de verhouding (grootte) van de patronen kan worden aangepast. Herhaal door de hoek, positie, ruimte tussen en verhouding van het patroon aan te passen totdat de patronen in lijn zijn met de rastervierkanten. Verplaats de microscooptrap om het gebied van het raster in het live brightfield-scherm te wijzigen. Druk op Vergrendelen om de wijzigingen in de regio op te slaan. Als u een gebied wilt kopiëren, klikt u op de knop Dupliceren (afbeelding 2, gebied 5, pictogram van twee vellen papier) naast de naam in het deelvenster Handelingen aan de linkerkant. Als u de kopie wilt verplaatsen, hernoemen of bewerken, klikt u op de naam in het deelvenster Actie. Herhaal stap 5.4-5.9 indien nodig om alle gewenste gebieden te vullen. Zodra de volledige sjabloon is ontworpen en gepositioneerd, slaat u het sjabloonbestand op in de software (Afbeelding 2, gebied 6, balk met pijl-omhoogpictogram in de bovenste werkbalk). Bij het laden van een eerder opgeslagen sjabloon (balk met pijl-omlaagpictogram) centreer je de ROI over het raster en druk je op Vergrendelen. Klik op elk gebied in het onderhoudspaneel om de hoek, positie, dosis en/of het patroonbestand te wijzigen. Zodra de sjabloon en patronen zijn gepositioneerd, schakelt u op één na alle regio’s in het onderhoudspaneel in de software uit. Gebruik de microscoopfase om naar dat gebied te navigeren en concentreer je op de koolstoffolie. Als u op het pictogram Oogbol in het deelvenster Handelingen (afbeelding 2, gebied 5) klikt, wordt de weergave van de patroonoverlay in- of uitgeschakeld. Zodra het raster scherp is, sluit u de brightfield-sluiter en drukt u op het pictogram Afspelen in de rechterbenedenhoek van de software om het patroonproces te starten, dat live kan worden gevolgd. Schakel in het actievenster het selectievakje voor het volgende gebied in. Open de brightfield-sluiter zodat het raster zichtbaar is en centreer dat gebied met behulp van de microscooptrap. Herhaal stap 5.13-5.14 voor elke regio in het Onderhoudspaneel. Verwijder de coverslip met het rooster uit de microscoop en pipetteer onmiddellijk 10 μL steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op het rooster. Verwijder na 10 minuten het stencil met een pincet en was het rooster vervolgens 3x met 15 μL PBS. Plaats na de laatste wasbeurt elk rooster in 15 μL PBS en verplaats de roosters naar een donkere locatie. 6. Depositie van ECM-eiwitten Voor gekweekte cellen volgt u stappen 6.2-6.5; voor primaire Drosophila-neuronen , volg stappen 6.6-6.10. Bereid ten minste 15 μL ECM voor elk rooster. Bereid voor BEAS-2B-cellen een eindconcentratie van 0,01 mg/ml runderfibronectine en 0,01 mg/ml fluorofoor-geconjugeerd fibrinogeen in steriel PBS. Bereid voor HeLa-cellen 0,01 mg/ml rundercollageen I en 0,1 mg/ml fluorofoor-geconjugeerd fibrinogeen in steriel PBS. Verwijder het grootste deel van de PBS uit elk raster en breng 15 μL van de ECU aan. Incubeer het rooster in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.OPMERKING: Deze stap kan worden verlengd tot ‘s nachts bij 4 °C. Was na incubatie in ECM elk rooster 5x met steriel PBS. Verwijder voor elke wasbeurt het grootste deel van de vloeistof met een pipet zonder het rooster te laten drogen, voeg 15 μL verse PBS toe, incubeer gedurende ten minste 30 s en herhaal dit. Laat elk rooster in PBS na de laatste wasbeurt.OPMERKING: Roosters kunnen maximaal een week worden bewaard in PBS bij 4 °C zonder waargenomen kwaliteitsverlies. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de fluorofoor in de ECU te detecteren om patronen te bevestigen en dat de koolstoffolie intact is gebleven. Een paar gebroken vierkanten zijn over het algemeen aanvaardbaar. Voor primaire Drosophila-neuronen verplaatst u de patroonrasters naar een 30 mm glazen bodemschaal met steriel PBS. Zuig de PBS uit de schaal en breng 2 ml 0,5 mg/ml fluorofoor-geconjugeerde concanavaline A. Incubateer een nacht bij 25 °C in een steriele omgeving. Haal de concanavaline A-oplossing uit de schotel (zonder de roosters te drogen) en was de roosters 3x met PBS. Voeg voor elke wasbeurt 2 ml PBS toe en verwijder deze uit de schaal. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de fluorofoor in de ECU te detecteren om patronen te bevestigen en dat de koolstoffolie intact is gebleven. Een paar gebroken vierkanten zijn over het algemeen aanvaardbaar. Verwijder na de laatste wasbeurt de PBS uit de glazen bodemschaal en voeg 2 ml vers bereid, steriel gefilterde aangevulde Schneider’s Drosophila media21 toe, met 20% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 5 μg / ml insuline, 100 μg / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine en 10 μg / ml tetracycline. Incubeer bij 25 °C in een steriele omgeving totdat de neuronen klaar zijn om te worden verguld. 7. Voorbereiding van primaire Drosophila-cellen voorafgaand aan het zaaien Steriliseer een 55 mm dissectieschaal met 70% EtOH en voeg vervolgens 2-3 ml steriel gefilterde 1× dissectiezoutoplossing (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM KH2PO4, 3,3 mM glucose, 43,8 mM sucrose) toe aan de schaal. Pluk 30-40 3e instarlarven voorzichtig uit het voedsel met een pincet. Plaats de larven in de buis met 1× PBS en breng ze vervolgens over in de tweede buis met 1× PBS om de larven te wassen. Breng de larven over in de buis met 70% EtOH om de PBS af te spoelen en breng ze vervolgens over in de tweede buis met 70% EtOH. Laat de larven 2-3 minuten in de tweede buis om de larven te steriliseren. Breng de larven over in een buis met 1× dissectiezoutoplossing en breng ze vervolgens onmiddellijk over in de tweede buis met 1× dissectiezoutoplossing. Breng individuele larven over op de ontleedschaal met 1× dissectiezoutoplossing. Scheur met een tang en een dissectiemicroscoop snel elke larve om de hersenen te extraheren en breng deze over naar de derde buis met 1× dissectiezoutoplossing. Herhaal dit totdat alle hersenen zijn geëxtraheerd. Centrifugeer de buis met de hersenen bij 300 x g gedurende 1 minuut. Gooi het supernatant weg en was met 1 ml 1× dissectiezoutoplossing en centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij 300 x g. Herhaal deze stap nog een keer. Gooi het supernatant weg totdat er 200-250 μL in de buis is achtergebleven en voeg 20 μL 2,5 mg/ml Liberase toe in 1x dissectiezoutoplossing. Draai de buis op een rotator gedurende 1 uur bij kamertemperatuur; pipetteer de oplossing gedurende dit uur 25-30 keer per 10 minuten. Tegen het einde moet de oplossing enigszins ondoorzichtig zijn. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en voeg vervolgens 1 ml aangevulde Schneider’s media toe. Pipetteer de oplossing 30 keer om te mengen. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 × g . Gooi het supernatant weg en was de celkorrel door 1 ml aangevulde Schneider’s media toe te voegen. Pipetteer de oplossing 30 keer om te mengen. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 300 μL aangevulde Schneider’s media. Pipetteer de oplossing 30-40 keer om te mengen. 8. Kweek- en RSV-infectie van BEAS-2B- en HeLa-cellen Houd HeLa-cellen en BEAS-2B-cellen in T75-kolven op 37 °C en 5 % CO2. Passagecellen om de 3-4 dagen eenmaal ongeveer 80% confluentie bereiken. Onderhoud HeLa-cellen in DMEM + 10% FBS + 1× Antibioticum-Antimycotisch. Handhaaf BEAS-2B in RPMI + 10% FBS + 1× Antibioticum-Antimycotica6,22,23. Ga voor het zaaien van niet-geïnfecteerde cellen naar sectie 9. BEAS-2B- en HeLa-cellen zijn gevoelig voor RSV-infectie; BEAS-2B-cellen werden gebruikt voor alle experimenten met RSV die hier worden getoond.OPMERKING: Voer alle BSL-2-stappen uit in overeenstemming met institutionele protocollen met behulp van een geschikte bioveiligheidskast (BSC) en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Voorafgaand aan RSV-infectie van cellen, passeren 5 × 104 cellen per put in een 6-well plaat (oppervlakte ~ 9,6 cm2) met 2 ml groeimedia en incubeer ‘s nachts. Trypsiniseren en één put van cellen tellen. Om trypsine te trypsiniseren, zuig media uit één put en was met 2 ml steriel PBS zonder Mg2+ en Ca2+ om restmedia te verwijderen. Voeg 500 μL 0,25% trypsine-oplossing toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-10 min. Controleer de cellen regelmatig om te zien of ze van het oppervlak worden vrijgegeven. Zodra de cellen zijn vrijgegeven, voegt u 1,5 ml kweekmedium toe. Meng 100 μL trypsinized cellen met 100 μL trypan blue. Pipetteer 10 μL verdund celmengsel in een hemocytometer. Tel de cellen en bereken het aantal cellen per put. Gebruik dit getal om MOI hieronder te berekenen. Bereid een verdunning van RSV-A2mK+24 in groeimedia voor om een MOI van 10 per put in 750 μL media te bereiken. De MOI van RSV-A2mK+ kan worden berekend uit fluorescentiefocus units (FFU) titers van de voorraad (Bijvoorbeeld: voor 1,0 × 105 cellen per put en een RSV-voorraad van 1,0 × 108 FFU / ml, verdun de virale voorraad 1:75 tot 1 × 106 FFU / 750 μL of 1,33 × 106 FFU / ml). Zuig de media uit de cellen in de 6-well schotel en voeg 750 μL van de virale oplossing van bovenaf toe aan elke put. Laat de plaat 1 uur op kamertemperatuur schommelen. Breng na 1 uur het totale volume per put op 2 ml met voorverwarmde groeimedia tot 37 °C en plaats de plaat in een incubator op 37 °C met 5% CO2 gedurende 6 uur. Trypsinize de cellen om ze vrij te geven en ga verder met zaaien zoals hieronder beschreven. Na het zaaien, incubeer de roosters nog eens 18 uur voordat u bevriest (voor een totaal van 24 uur na infectie). 9. Cel zaaien op microgepatterde roosters Voor gekweekte cellen volgt u stappen 9.2-9.8; voor primaire Drosophila-neuronen , volg 9.9-9.11. Trypsiniseren van de cellen om ze vrij te geven (zie stap 4 in rubriek 8 hierboven). Om celaggregatie te verminderen, trypsiniseren de cellen met 60% of minder confluentie. Meng 100 μL trypsinized cellen met 100 μL trypan blue. Pipetteer 10 μL van het verdunde celmengsel in een hemocytometer en tel de cellen. Verdun de cellen in media tot 2 × 104 cellen/ml. Voeg 1 μL media toe aan het midden van een glazen bodemschaal van 30 mm om te helpen bij het plaatsen van het rooster en te voorkomen dat het uitdroogt. Breng het rooster van de PBS op de afdekplaat over naar het midden van de glazen bodemschaal. Voeg 10 μL celoplossing toe aan het rooster. Observeer met behulp van een brightfield-microscoop de celhechting aan het raster na 5 minuten. Als een meerderheid van de patronen onbezet blijft, voegt u een extra druppel van 10 μL van de celoplossing toe. Houd de roosters en celoplossing tijdens de incubaties op 37 °C. Herhaal stap 9.6 totdat de meeste patronen bezet zijn of veel bezette patronen meerdere cellen beginnen te hebben. Incubeer het rooster gedurende 2 uur in de incubator (37 °C, 5% CO2). Overspoel de schaal met 2 ml voorverwarmde media en incubeer een nacht (37 °C, 5% CO2). Voor primaire Drosophila-neuronen verwijdert u de media uit de rasterbevattende schotel en plaatst u de cellen op de schaal. Wacht 30-60 minuten tot de cellen zich hechten en voeg vervolgens 2 ml aangevulde Schneider’s media toe. Kweek de neuronen in een incubator van 25 °C gedurende minimaal 2-3 dagen voordat ze bevriezen. 10. Beeldvorming en vitrificatie van rasterpatronen Plaats de glazen bodemschaal met het patroonraster en de gekweekte cellen op de fluorescentiemicroscoop. Verkrijg afbeeldingen van het raster met behulp van brightfield en de juiste fluorescerende kanalen om het patroon en eventuele andere labels in de cellen te detecteren. Zorg ervoor dat de celdichtheid en positionering geschikt is voor downstream beeldvorming en analyse.OPMERKING: Brightfield- en fluorescerende beelden werden verwerkt in het FIJI-softwarepakket25. Bereid een cryo-plunge vriezer voor; het type vriesapparaat is afhankelijk van beschikbaarheid, kosten en functies die het meest geschikt zijn voor het monster.OPMERKING: Primaire Drosophila-neuronen werden bereid op een geautomatiseerde plunge-freezer en de BEAS-2B-cellen werden bereid met behulp van een semi-geautomatiseerde plunge-freezer. Breng gouden fiducials aan op de monsters voor een goede uitlijning van de kantelserie. Dep monsters om overtollige media te verwijderen en vries de monsters vervolgens in een cryogeen, zoals vloeibaar ethaan gekoeld door vloeibare stikstof. Voor primaire Drosophila-neuronen , dep gedurende 4 s vanaf de achterkant. Voor HeLa- en BEAS-2B-cellen, dep van beide kanten voor 4-6 s. De bevroren roosters kunnen vervolgens tot verder gebruik worden opgeslagen in vloeibare stikstof. Beeld verglaasde cellen in een cryo-elektronenmicroscoop, bediend op 300 kV met een directe elektronendetectorcamera. Stel de verzameling van tilt-series in voor elke interessante regio met software zoals SerialEM26 voor cryo-EM/cryo-ET-gegevensverzameling.OPMERKING: Tilt-series van primaire Drosophila neuronen werden verzameld op een directe elektronendetector van -60° tot 60° bidirectioneel bij stappen van 2° bij -8 μm onscherpte met een pixelgrootte van 4,628 Å voor een totale dosis van 70-75 e-/Å2. Tilt-series van RSV-geïnfecteerde BEAS-2B werden verzameld op een directe elektronendetector met een energiefilter (20 eV spleet) bij -5 μm onscherpte met een pixelgrootte van 4,603 Å en een totale dosis van ~ 80 e-/Å2. Verwerk de kantelreeks om tomogrammen te reconstrueren.OPMERKING: Tomogrammen die hier worden gepresenteerd, zijn gereconstrueerd met behulp van het IMOD-pakket27; lowpass filtering werd gedaan met behulp van het EMAN2 softwarepakket28.

Representative Results

Deze procedure werd gebruikt om EM-rasters te modelleren voor cryo-ET-experimenten met hele cellen. De volledige workflow die in deze studie wordt gepresenteerd, inclusief initiële celkweekpreparaten, micropatterning (figuur 1) en beeldvorming, omvat 3-7 dagen. Een procedure in twee stappen werd gebruikt om de aangroeiwerende laag te genereren door PLL op het raster aan te brengen en vervolgens PEG te koppelen door toevoeging van de reactieve PEG-SVA. De aangroeiwerende laag kan ook in één stap worden aangebracht door PLL-g-PEG in één incubatie toe te voegen. De PLPP-gel is een katalysator voor de UV-micropatterning, die ook verkrijgbaar is als een minder geconcentreerde vloeistof. De gel zorgt voor patroonvorming in een aanzienlijk lagere dosis in vergelijking met de vloeistof, wat resulteert in veel snellere patronen. Met dit systeem was de werkelijke patroontijd van een volledig TEM-raster ~ 2 minuten. De micropatterning-workflow alleen al beslaat over het algemeen 5-6 uur en stelt een individu in staat om acht rasters te ontwerpen voor standaard celcultuur op TEM-rasters. Een aantal stappen tijdens het micropatterningproces vereisen lange incubatietijden (zie stappen 2.1, 2.3, 6.4). Handig is dat sommige van deze stappen, zoals PLL-passivering (2.1) of PEG-SVA-passivering (2.3), kunnen worden uitgebreid tot een nachtelijke incubatie. Bovendien kunnen roosters van tevoren worden gemodelleerd en opgeslagen in een oplossing van het ECM-eiwit of PBS voor later gebruik. In onze studie waren deze opties waardevol in gevallen waarin de timing van celvoorbereiding en zaaien van cruciaal belang is, zoals primaire Drosophila-neuronen en RSV-infectie van BEAS-2B-cellen. Rasters werden voorbereid in een algemene bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) laboratoriumomgeving met behulp van schoon gereedschap, steriele oplossingen en opgenomen antibiotica / antimycotica in de groeimedia6,22,29,30. Voor monsters die bijzonder gevoelig zijn voor microbiële besmetting, kunnen de aangroeiwerende laag en ECM worden aangebracht in een weefselkweekkap of een andere steriele omgeving. Bovendien kon het rooster worden gewassen in ethanol tussen patroonvorming en ECM-toepassing. Als u met infectieuze agentia werkt, is het belangrijk om de procedure aan te passen om te voldoen aan de juiste bioveiligheidsprotocollen. Deze workflow en de gepresenteerde procedures (figuur 1) maakten het mogelijk hela-cellen (figuur 4), RSV-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen (figuur 3, figuur 5) en primaire Drosophila-larvale neuronen (figuur 6, figuur 7) te zaaien op patroon-EM-rasters voor optimale cryo-ET-gegevensverzameling. HeLa-cellen gezaaid op microgepatterde TEM-rasters blijven levensvatbaar zoals bepaald door fluorescerende kleuring met behulp van een op calceïne-AM en ethidium homodimeer-1 gebaseerde cel levensvatbaarheidstest (figuur 4A, B). Met behulp van een gemengd ECM van collageen en fibrinogeen hechten HeLa-cellen zich gemakkelijk aan patronen in het raster (figuur 4A, C). De algemene morfologie van cellen die zich langs het patroon uitbreiden, is vergelijkbaar met die van cellen die op ongepatterde rasters zijn gegroeid (figuur 4C, D). In het geval van HeLa-cellen blijft de totale celdikte ~ < 10 μm met aanzienlijk dunnere gebieden ~ < 1 μm dik in de buurt van de celrand (figuur 4E, F). Voor RSV-studies hebben we hele rastervierkanten gemodelleerd met behulp van een gradiënt, met een lage dosisblootstelling aan de randen en een hoger dosispatroon naar het midden (figuur 3A). Gradiëntpatronen leverden betere resultaten op bij het zoeken naar vrijgekomen virussen die aanwezig waren in de buurt van de periferie van cellen. Met deze patronen bleken cellen zich bij voorkeur te hechten aan de hogere ECM-concentratie, maar ook in staat zijn om zich te hechten aan en te groeien op de lagere ECM-concentraties. De relatieve dosis tussen de gebieden moet worden geoptimaliseerd bij het gebruik van patronen die meerdere doses vereisen. Als de doses en dus ECM-concentraties te veel op elkaar lijken of te verschillend zijn, zal het effect van het gebruik van meerdere doses verloren gaan. In figuur 3 werd een TEM-raster gemodelleerd en vervolgens gezaaid met RSV-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen en gebruikt voor cryo-EM-gegevensverzameling. Figuur 4A is een fluorescerende afbeelding van ECM met een PATROON op een TEM-raster met behulp van een verlooppatroon. Celhechting en groei langs het centrale gebied van het patroon zijn te zien in figuur 3B als een brightfield-afbeelding van de cellen 18 uur na het zaaien. In figuur 3C wordt het fluorescerende signaal (rood) van replicatie van RSV-A2mK+ bedekt met het signaal van de ECU. De meerderheid van de geïnfecteerde cellen bevindt zich langs het centrale gebied met hogere dichtheid van het gradiëntpatroon. Een low-mag TEM-kaart van het raster na cryofixatie onthult een aantal cellen, waaronder RSV-geïnfecteerde cellen, gepositioneerd op de koolstoffolie in de buurt van het midden van de rastervierkanten. Zoals eerder aangetoond voor cellen gekweekt op standaard TEM-rasters22, werden tilt-series gelokaliseerd en verzameld van RSV-virionen in de nabijheid van de periferie van geïnfecteerde BEAS-2B-cellen gekweekt op microgepatterde rasters (figuur 5A, B). Veel van de RSV-structurele eiwitten kunnen worden geïdentificeerd in de tomogrammen, waaronder nucleocapside (N) en het virale fusie-eiwit (F) (respectievelijk figuur 5C, blauwe en rode pijlen). Voor primaire Drosophila-neuronstudies werd gevonden dat het smalle patroon, in de buurt van de resolutielimiet die door de software werd aangeboden (waarbij de dikte van het patroon 2 μm was), het mogelijk maakte om van één tot enkele cellen te worden geïsoleerd binnen een rastervierkant (figuur 6). De neuronale soma was in staat om zijn neurieten uit te breiden over een periode van enkele dagen binnen het patroon. Dit maakte eenvoudige identificatie en kantelreeksacquisitie van de neurieten mogelijk in vergelijking met neuronen gekweekt op niet-gepatterde rasters (figuur 7). Er werd ook vastgesteld dat fluorescerend gelabeld concanavaline A, een lectine dat is gebruikt als een ECM voor in vitro Drosophila neuronale culturen20,21, vatbaar is voor patroonvorming. Drosophila-neuronen van derde instarlarven werden geïsoleerd volgens eerder gepubliceerde protocollen20,21,31. De neuronale preparaten werden toegepast op microgepatterde cryo-EM-rasters waar concanavaline A op het patroon werd afgezet om de celplaatsing, verspreiding en organisatie te reguleren. De neuronen op patroonvormige of ongepatterde roosters mochten minimaal 48-72 uur incuberen en de roosters werden vervolgens bevroren. Een representatief beeld van een microgepatterd EM-raster met verschillende Drosophila-neuronen verdeeld over de patroongebieden is weergegeven in figuur 6A. Deze neuronen, afgeleid van een transgene vliegenstam met pan-neuronale GFP-expressie in het membraan, kunnen gemakkelijk worden gevolgd door lichtmicroscopie, niet alleen vanwege de fluorescerende etikettering, maar ook vanwege de locatie in de micropatronen. Terwijl neuronen gekweekt op ongepatterde rasters ook kunnen worden gevolgd via de GFP-signalering door lichtmicroscopie (figuur 7A, gele cirkel), werd het lokaliseren ervan in cryo-EM aanzienlijk moeilijker vanwege de aanwezigheid van cellulair puin en besmetting van de media (figuur 7B, gele cirkel). Een dergelijke aanwezigheid werd verminderd voor neuronen op patroonrasters, waarschijnlijk als gevolg van de PEG in de anti-aangroeilaag van de niet-patroongebieden die het celafval afstoten van hechting. Vanwege de afmetingen van het neuroncellichaam en de uitgebreide neurieten (figuur 6A, B, gele cirkel), werden cryo-ET-kantelseries verzameld langs dunnere gebieden van de cellen (figuur 6C, D, rode cirkel). Het neuronale celmembraan, een mitochondrion (cyaan), microtubuli (paars), actinefilamenten (blauw), vesiculaire structuren (oranje en groen) en macromoleculen zoals ribosomen (rood) werden goed opgelost in beeldmontages met een hogere vergroting en plakjes door het 3D-tomogram (figuur 6E). Hoewel vergelijkbare subcellulaire kenmerken te zien zijn aan 3D-tomogrammen van niet-gepatterde neuronen (figuur 7E), verminderde de moeilijkheid bij het lokaliseren van levensvatbare cellulaire doelen voor gegevensverzameling de doorvoer aanzienlijk. In figuur 8 zijn representatieve afbeeldingen van rasters met enkele van deze problemen samengesteld om te helpen bij het identificeren en oplossen van problemen. Zodra optimale omstandigheden zijn bepaald, is micropatterning een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het positioneren van cellen op roosters voor cryo-TEM. Figuur 1: Algemene workflow van micropatterning voor cryo-EM. De workflow kan grofweg uit vier delen bestaan: Grid preparation, micropatterning, ECM en cell seeding, en cryo-preparation en dataverzameling. De belangrijkste stappen van elke sectie worden onder de koppen weergegeven en de geschatte tijd om elke sectie te voltooien wordt aan de linkerkant weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Schermafbeelding van de software met patroon op het raster. Gebied 1 bevat de μm/pix-verhouding voor patroonontwerp. Gebied 2 is de liniaal voor het meten van een raster. Gebied 3 is waar patronen en ROI’s kunnen worden toegevoegd of gewijzigd. Gebied 4 bevat alle informatie voor patroonpositionering en dosis. Gebied 5 bevat opties voor patronen, zoals het schakelen tussen overlays, het kopiëren of verwijderen van patronen en het selecteren van patronen voor micropatterning. Gebied 6 is waar sjablonen kunnen worden opgeslagen en geladen. Grotere weergaven van gebieden 4 en 5 worden hieronder voor de duidelijkheid weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: RSV-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen op het cryo-TEM-raster met patroon. (A) Fluorescerend beeld van het patroonraster na toevoeging van fluorescerend gelabelde ECM. Het invoerpatroon wordt weergegeven in de linkerbenedenhoek. (B) Brightfield-afbeelding van BEAS-2B-cellen die op het raster zijn gegroeid in A. (C) Samenvoeging van het beeld in A (cyaan) en B (grijs) met fluorescerend beeld van RSV-geïnfecteerde cellen (rood) onmiddellijk voorafgaand aan het bevriezen; geïnfecteerde cellen drukken mKate-2 uit. Schaalstaven zijn 500 μm. (D) Cryo-TEM-kaart met lage vergroting van het raster in B na bevriezing. Fluorescerende beelden zijn pseudogekleurd. Schaalbalken zijn 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Levend/Dood kleuring van patroon- en ongepatterde cellen. (A) Fluorescerend beeld van HeLa-cellen gekweekt op een rasterpatroon en gekleurd met calceïne-AM (levende celvlek, groen) en ethidium homodimeer-1 (dode celvlek, rood). (B) HeLa-cellen gekweekt op een ongepatterd raster en gekleurd zoals in A. (C) Projectie van confocale z-stacks van een HeLa-cel op een patroon Quantifoil R2/2-raster met 0,01 mg / ml collageen en fibrinogeen 647 ECM (rood). Cel was gekleurd met calceïne-AM (groen) en Hoechst-33342 (blauw). (D) HeLa-cellen op ongepatterd raster geïncubeerd met 0,01 mg/ml collageen en fibrinogeen 647 ECM, geïncubeerd en gekleurd met calceïne-AM en Hoecsht-33342. De fluorescerende beelden werden samengevoegd met doorgelaten licht (grijswaarden). (E) X,Z projectie van C. (F) X,Z projectie van D. Afbeeldingen zijn pseudogekleurd. Schaalbalken in (A) en (B) zijn 500 μm; schaalbalken in (C) – (F) zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Cryo-ET van RSV-geïnfecteerde BEAS-2B-cel op het patroon cryo-TEM-raster. (A) Cryo-EM-raster vierkante kaart van RSV geïnfecteerde BEAS-2B-cel. De geschatte celgrens wordt aangegeven door de onderbroken groene lijn. (B) Afbeelding met hogere resolutie van het gebied in rood ingepakt in (A). De geschatte celgrens wordt aangegeven met een onderbroken groene lijn. RSV-virionen zijn te zien in de buurt van de celrand (witte pijl en gele doos). (C) Enkele z-slice van tomogram verzameld in het gebied van het gele vak in (B). Rode pijlen wijzen naar RSV F fusie-eiwit, blauwe pijlen wijzen naar het ribonucleoproteïne (RNP) complex. De schaalbalken in (A)-(C) zijn ingesloten in de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Primaire neuronen afgeleid van de hersenen van 3e instar Drosophila melanogaster larven op het patroon cryo-TEM raster. (A) Overlayd live-cell fluorescentie microscopie rastermontage van Drosophila neuronen die membraan-gerichte GFP tot expressie brengen op patroon raster vierkanten met 0,5 mg / ml fluorescerende concanavaline A. Green: Drosophila neuronen. Blauw: Fotopattern. (B) Cryo-EM beeldmontage van het rooster in (A) na cryoconservering. Gele cirkel geeft hetzelfde rastervierkant aan als in (A). (C) Cryo-EM beeldmontage van het vierkant gemarkeerd door de gele cirkel in (A) en (B). (D) Hogere vergrotingsbeeld van het gebied begrensd door de rode cirkel in (C), waar een kantelreeks werd verzameld op de neurieten van de cel. E. 25 nm dikke plak van een tomogram gereconstrueerd uit de kantelreeks die werd verkregen uit de rode cirkel in (C). Verschillende organellen zijn te zien in dit tomogram, zoals de mitochondriën (cyaan), microtubuli (paars), dichte kernblaasjes (oranje), lichte blaasjes (groen), het endoplasmatisch reticulum (geel) en actine (blauw). Macromoleculen, zoals ribosomen (rood), zijn ook te zien in de rechterbovenhoek. Fluorescerende beelden zijn pseudogekleurd. De schaalbalken in (A)-(E) zijn ingesloten in de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Primaire neuronen afgeleid van de hersenen van 3e instar Drosophila melanogaster larven op ongepatterde rasters. (A) Live-cell fluorescentie microscopie rastermontage van Drosophila neuronen die membraan-gerichte GFP tot expressie brengen op raster vierkanten met 0,5 mg / ml concanavaline A. Green: Drosophila neuronen. (B) Cryo-EM-rastermontage van hetzelfde raster in (A) na het invriezen. Gele cirkel toont hetzelfde rastervierkant als in (A). Let op de aanwezigheid van cellulair puin en mediabesmetting, wat doelidentificatie moeilijk maakte in vergelijking met patroonrasters. (C) Cryo-EM beeldmontage van het vierkant gemarkeerd door de gele cirkels in de (A) en (B) kaarten. (D) Hogere vergrotingsbeeld van het gebied begrensd door de rode cirkel in (C), waar een kantelreeks werd verzameld op de neurieten van de cel. (E) 25 nm dikke plak van het gereconstrueerde tomogram uit de kantelreeks van (C) en (D). Een aantal organellen zijn zichtbaar in dit tomogram, zoals microtubuli (paars), actine (blauw), het endoplasmatisch reticulum (geel) en dichte kernblaasjes (oranje). Macromoleculen, zoals ribosomen (rood), zijn ook te zien. Fluorescerende beelden zijn pseudogekleurd. De schaalbalken in (A)-(E) zijn ingesloten in de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Voorbeelden van mogelijke problemen met patronen. Fluorescerende beelden van gelabelde ECM gedeponeerd op microgepatterde rasters. (A) Ongelijke patronen over het net als gevolg van ongelijke verdeling van PLPP-gel. (B) ECM kan zich tijdens het patroonpatroon niet hechten aan gebieden die door het PDMS-stencil worden bedekt. (C) Verzadigd gradiëntpatroon (rechterkant) of omgekeerd patroon (links) op een rasterpatroon met een te hoge totale dosis. (D) ECM hecht zich aan gebieden op de rasterbalken en aan het patroongebied als gevolg van reflecties van de UV-laser tijdens het patroonvorming. Afbeeldingen zijn pseudogekleurd; het invoerpatroon wordt linksonder weergegeven; schaalbalken zijn 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Uitgeven Mogelijke oorzaak(en) Probleemoplossing Micropatterning Kan verlichting van PRIMO-laser niet zien • Lichtpad is niet correct ingesteld • Controleer of het lichtpad van de microscoop goed is ingesteld • PRIMO-laser is niet ingeschakeld of de laser is in elkaar grijpen Veel gebroken rastervierkanten • Aanraken van rasterfolie met pincet of pipet tijdens het hanteren • Behandel roosters met zorg • Rooster uitgedroogd tijdens incubaties of wassen • Laat het rooster niet drogen tijdens wasbeurten en incubaties Grote ongeverfde gebieden • Onvoldoende geldekking • Zorg ervoor dat gel zich gelijkmatig over het rooster verspreidt tijdens het toevoegen • Rasterfolie onscherp tijdens het patroon • Voeg een extra microliter gel toe •Gebied bedekt met stencil • Controleer de focus voordat u elke regio een patroon geeft • Rooster zorgvuldig centreren in stencil Verzadigd of omgekeerd patroon • Onjuiste dosis • Probeer een reeks totale doses voor patroon • Onvoldoende geldekking • Zorg ervoor dat het rooster gelijkmatig bedekt is met gel • Probeer verschillende waarden voor grijswaardenpatronen Wazig patroon • Slechte focus tijdens het patroonvorming • Herhaal primo-kalibratie op dezelfde hoogte als het monster • Onjuiste kalibratie • Focus op rasterfolie voordat u patronen maakt • Verdeel het patroon in extra gebieden voor patroonvorming ECM hecht buiten het patroon • Reflecties van gel of stof • Zorg ervoor dat de gel droog is voordat u een patroon maakt • Zorg ervoor dat coverslip en objectieflens schoon zijn ECM niet zichtbaar na patroonvorming • Foto bleken • Minimaliseer blootstelling aan ECM voorafgaand aan beeldvorming • Onjuiste dosis tijdens patroonvorming • Probeer een reeks totale dosiswaarden voor het patroon • Onvoldoende ECM incubatietijd • Verhoog de incubatietijd voor ECM Cel zaaien Cellen klonteren • Oververtering • Gebruik een lager percentage trypsine of tijd voor afgifte van aanhangende cellen • Hoge celdichtheid • Passage en/of verteercellen bij lagere confluentie • Roer cellen niet tijdens het loslaten • Pipetteer voorzichtig celoplossing of gebruik celzeefjes Cellen die zich niet aan patroongebieden hechten • ECM is niet geschikt voor celtype • Probeer verschillende ECM-concentraties en samenstelling • De levensvatbaarheid van cellen is verminderd voorafgaand aan het zaaien • Zorg ervoor dat celkweek en celafgifteomstandigheden cellen niet beschadigen Cellen die niet uitzetten na hechting • ECM of patroon niet geschikt voor celtype • Probeer verschillende patronen en ECM • In sommige gevallen kan een meer continue folie (R1.2/20 vs R2/1) celuitbreiding bevorderen Tabel 1: Mogelijke problemen tijdens micropatterning. In deze tabel worden enkele problemen beschreven die een gebruiker kan ondervinden tijdens het micropattteren of het zaaien van cellen. Mogelijke oorzaken en probleemoplossing worden voor elk probleem verstrekt. Representatieve beelden van sommige problemen zijn te zien in figuur 8.

Discussion

Moderne, geavanceerde elektronenmicroscopen en softwarepakketten ondersteunen nu gestroomlijnde geautomatiseerde cryo-EM- en cryo-ET-gegevensverzameling waarbij honderden tot duizenden posities binnen enkele dagen kunnen worden gericht en in beeld gebracht32,33,34,35. Een belangrijke beperkende factor voor cryo-ET-workflows met hele cellen is het verkrijgen van voldoende verzamelbare doelen per raster. Onlangs hebben een aantal groepen protocollen ontwikkeld voor micropatterning-rasters voor cryo-EM, met als voordeel een verbeterde efficiëntie van gegevensverzameling16,17,18. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van een commercieel beschikbaar micropatterningsysteem om TEM-rasters te micropatttern voor cryo-ET-studies van primaire Drosophila-neuronen en gekweekte menselijke cellijnen (niet-geïnfecteerd of RSV-geïnfecteerd). Dit micropatterningsysteem is veelzijdig en vele stappen kunnen worden geoptimaliseerd en afgestemd op specifieke experimentele doelen. Een gebruiker met TEM- en fluorescentiemicroscopie-ervaring kan snel bekwaam worden in rastervoorbereiding en micropatterning. Met zorgvuldige oefening moeten goede resultaten haalbaar zijn na een paar iteraties. Hieronder worden enkele van de beschikbare opties, gebruikersoverwegingen, potentiële voordelen en toekomstige toepassingen van micropatterning voor cryo-EM besproken.

Een van de belangrijke overwegingen voor cryo-ET voor hele cellen is EM-rasterselectie. EM-rasters bestaan uit twee delen: een gaasframe (of structurele ondersteuning) en de folie (of film), het continue of gatenachtige filmoppervlak waarop cellen zullen groeien. Koperen gaasroosters worden vaak gebruikt voor cryo-EM van eiwitten en geïsoleerde complexen. Ze zijn echter ongeschikt voor cryo-ET met hele cellen vanwege de cytotoxiciteit van koper. In plaats daarvan wordt een gouden gaas vaak gebruikt voor cellulaire tomografie. Andere opties zijn nikkel of titanium, wat voordelen kan bieden ten opzichte van goud, zoals een verhoogde ^stijfheid16. EM-roosters zijn verkrijgbaar met verschillende maasafmetingen om een reeks toepassingen te ondersteunen. Grotere maaswijdten bieden meer ruimte voor cellen om te groeien tussen roosterbalken en meer gebieden die geschikt zijn voor het verzamelen van kantelseries, hoewel dit ten koste gaat van een verhoogde algehele kwetsbaarheid van het monster. De meest gebruikte folie is geperforeerde of holey amorfe koolstof, zoals Quantifoils of C-flat roosters. Biologische doelen kunnen worden afgebeeld door de gaten in de koolstof of door de elektrondoorschijnende koolstof. Rasters zoals R 2/1 of R 2/2, waarbij de gaten 2 μm breed zijn en respectievelijk 1 en 2 μm uit elkaar staan, bieden een groot aantal gaten en dus een groot aantal potentiële gebieden voor gegevensverzameling. Sommige cellen kunnen echter beter groeien en uitbreiden op meer uniforme oppervlakken zoals R 1.2 / 20-rasters of continue koolstof. Voor downstream monsterverwerking door focused-ion beam milling (cryo-FIB) wordt de folie verwijderd door middel van frezen, waardoor zorgen over de voortdurende aanwezigheid van de onderliggende film worden verminderd. Net als bij het gaas zijn er ook folies van andere materialen beschikbaar, waarbij het hier gepresenteerde patroonprotocol even geschikt is voor _{SiO2-roosters} . Veelgebruikte rasters zijn goud Quantifoil, continue koolstof of _SiO2-film 200-mesh roosters (~ 90 μm afstand tussen rasterstaven) voor cryo-ET voor hele cellen.

Er zijn een aantal overwegingen bij het ontwerpen van een patroon. Een meerderheid van deze beslissingen wordt geleid door het celtype en het doel van het experiment. Een goed uitgangspunt is om een patroon te kiezen dat de vorm en afmetingen van de cellen in cultuur benadert. Veel studies hebben significante effecten van patroonvorm op celgroei en cytoskeletale arrangementen aangetoond13,36,37. Speciale zorg moet worden genomen tijdens het ontwerpen van het patroon als dit het doel van belang kan veranderen. Verschillende patronen voor elk celtype werden getest om te bepalen welke patronen cellulaire adhesie en groei bevorderden. De flexibiliteit van het micropatterningsysteem maakt het mogelijk om meerdere patronen op één raster te testen en patronen voor verschillende rasters binnen één experiment te veranderen. Grotere patronen (~ 50-90 μm), zoals die hier worden gebruikt, verhogen de kans dat meerdere cellen zich aan een enkel gebied van het patroon hechten en laten cellen uitzetten en uitbreiden na adhesie. Meer beperkte patronen (20-30 μm) kunnen geschikt zijn in experimenten waar celisolatie kritischer is dan celuitbreiding, zoals voor experimenten met gericht ionenbundelfrezen (cryo-FIB). Voor tomografietoepassingen moet men mogelijk rekening houden met de impact van de kantelas. Als een patroon zo is gepositioneerd dat alle cellen parallel aan elkaar in één richting groeien, is het mogelijk dat alle cellen loodrecht op de kantelas staan wanneer ze op de microscooptrap worden geladen, wat resulteert in een lagere kwaliteit van de gegevens.

Op niet-gepatterde rasters hechten cellen zich vaak bij voorkeur aan de rasterbalken, waar ze niet door TEM kunnen worden afgebeeld. Zelfs op rasters met patronen worden cellen vaak waargenomen in de hoeken van rastervierkanten, gedeeltelijk op zowel de koolstoffolie als de rasterbalk met patroon. Onlangs werd micropatterning gebruikt om opzettelijk een deel van de cel over de rasterbalk ^{te plaatsen18}. Dit kan worden overwogen voor experimenten waarbij het niet van cruciaal belang is om de hele celrand op de folie te hebben. Dit kan vooral belangrijk zijn voor cellen die groter kunnen worden dan een enkel rastervierkant, zoals primaire neuronen die gedurende meerdere dagen groeien.

Er zijn veel tools die kunnen worden gebruikt om een patroon te ontwerpen. Hier was het patroon beperkt tot minder dan 800 pixels in elke dimensie, zodat het patroon onder elke hoek kan worden gedraaid en nog steeds past binnen het maximale gebied dat door dit micropatterningsysteem in een enkele projectie kan worden gemodelleerd. Hierdoor kan de gebruiker het patroon roteren om goed te worden georiënteerd met het raster, ongeacht de oriëntatie van het raster op de microscoop. Hier werd het raster verdeeld in zes patroongebieden. Dit maakt in de eerste plaats focusaanpassing tussen verschillende regio’s van het raster mogelijk. Vooral gouden roosters zijn zeer kneedbaar en mogen niet helemaal plat op het glas liggen. De juiste focus is essentieel voor schone, verfijnde patroonresultaten. Door gesegmenteerde patronen te gebruiken, hoeven slechts kleine aanpassingen aan de patroonpositie te worden aangebracht als het raster enigszins verschuift tijdens het patroonproces, hoewel dit meestal geen probleem is bij het gebruik van de PLPP-gel met de PDMS-stencils. Tot slot bleven de centrale vier rastervierkanten van het raster ongepatterd. Dit ondersteunt een gebruiker om het centrum van het raster duidelijk te identificeren, wat erg handig is voor experimenten met correlatieve beeldvorming.

De patroonsoftware voor dit micropatterningsysteem, Leonardo, heeft ook meer geavanceerde functies zoals stiksels en de mogelijkheid om patronen als PDF’s te importeren, die buiten het bereik van dit protocol vallen. Deze software omvat ook microstructuurdetectie en geautomatiseerde patroonpositionering die kan worden gebruikt op TEM-rasters. Deze functie is het handigst wanneer het raster erg vlak is en kan worden gemodelleerd zonder dat de focus tussen verschillende gebieden hoeft te worden aangepast.

Selectie van een ECM-eiwit kan een aanzienlijke invloed hebben op de hechting en expansie van cellen. Van sommige cellen is bekend dat ze fysiologische veranderingen ondergaan wanneer ze op specifieke substraten worden ^gekweekt38. Meerdere ECM-eiwitten en concentraties werden getest op elk nieuw celtype op basis van eerder werk dat in de literatuur werd gerapporteerd. Laminine, fibrinogeen, fibronectine en collageen worden veel gebruikt voor gekweekte cellen en kunnen als uitgangspunt worden gebruikt als andere gegevens niet beschikbaar zijn. Andere ECM-eiwitten moeten echter ook worden overwogen als de veelgebruikte ECM-eiwitten er niet in slagen om de juiste hechtingseigenschappen voor de cellen te verlenen. Dit gold met name voor primaire Drosophila-neuronen , omdat een hoge concentratie van het plantaardige lectine concanavaline A noodzakelijk was voor een goede cellulaire hechting. De compatibiliteit van cellulaire hechting en groei met de ECU kan worden getest door patronen op glazen schalen of dia’s te maken voordat ze overgaan op TEM-rasters. Deze pre-screening aanpak is tijd- en kosteneffectief als een groot aantal combinaties moet worden onderzocht. De opname van een fluorescerend geconjugeerd ECM-eiwit is waardevol voor het beoordelen van het succes en de kwaliteit van patronen.

Cell seeding is een van de belangrijkste stappen voor cryo-ET voor hele cellen, met of zonder micropatterning6,16,39. Voor primaire Drosophila of andere neuronen, die fragiel zijn, onstabiel in suspensie en beperkt in hoeveelheid, hebben single seeding-benaderingen de voorkeur boven gecontroleerde, sequentiële celzaaiing. Een enkele seeding-stap bij een geoptimaliseerde celdichtheid, zoals beschreven in het protocol voor Drosophila-neuronen, is een haalbare optie voor de meeste celtypen. Het is echter ook mogelijk om cellen in een lagere beginconcentratie op het substraat te zaaien en meer cellen toe te voegen op een gecontroleerde manier zoals hier en in andere literatuur ^beschreven18. Deze sequentiële zaaiing kan in sommige gevallen consistentere resultaten opleveren. Net als bij standaard celkweek moet er altijd voor worden gezorgd dat de levensvatbaarheid van de cel behouden blijft en dat celklontering tijdens isolatie wordt geminimaliseerd.

Wanneer je voor het eerst begint met micropatterning, zijn er een paar mogelijke valkuilen die schadelijk zijn voor het eindresultaat. Zorgvuldige rasterbehandeling en steriele techniek, een uniforme verdeling van de PLPP-gel, de juiste dosis en focus tijdens het patroon en het behoud van de levensvatbaarheid van de cel voorafgaand aan het zaaien behoren tot de belangrijkste overwegingen voor succes. Een lijst van enkele van de mogelijke problemen en oplossingen werd verzameld in tabel 1.

Microgepatterde rasters kunnen worden gebruikt om cellen te helpen bij het positioneren van een consistente celdichtheid over het raster en om interessante gebieden te positioneren in gebieden die geschikt zijn voor het verzamelen van ^{tilt-series16,18}. De plaatsing en positionering van cellen kan worden gebruikt als fiduciale markers voor correlatie in cryo-CLEM-experimenten, waardoor de behoefte aan fragiele finder-grids en fluorescerende fiduciale markers wordt verminderd. Er moet echter worden opgemerkt dat dergelijke fiduciale markers nog steeds nuttig kunnen zijn voor de correlatie van de nauwkeurigheid van ^{submicrometer29,40}. Bovendien is een gelijkmatige verdeling van geïsoleerde cellen ook zeer gunstig voor focused-ion beam milling (cryo-FIB) experimenten om het aantal cellen waaruit lamellen kunnen worden gesneden te ^{maximaliseren16}.

De toevoeging van micropatterning aan cryo-EM-workflows zal resulteren in meetbare verbeteringen in de gegevensdoorvoer en mogelijk nieuwe experimenten mogelijk maken. Naarmate de techniek verder wordt toegepast en ontwikkeld, zullen meer geavanceerde toepassingen van micropatterning, waaronder ECM-gradiënten, meerdere ECM-deposities en microstructuurassemblage, de mogelijkheden van cryo-ET verder uitbreiden om biologische doelen en processen in volledige cellulaire context te bestuderen.

Materials

0.1% (w/v) Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML
0.22 µm syringe filters PVDF membrane	Genesee	25-240
22×60-1 Glass cover slip	Fisher	12545F
5/15 Tweezers	EMS (Dumont)	0203-5/15-PO
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher (Gibco)	15240096
BEAS-2B cells	ATCC	CRL-9609
Collagen I, bovine	ThermoFisher (Gibco)	A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate	ThermoFisher (Invitrogen)	C11254
DMEM	Fisher (Lonza)	BW12-604F
EtOH	Fisher (Decon Labs)	22-032-600
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate	ThermoFisher (Invitrogen)	F35200
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher (Gibco)	33010018
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C
Glucose	VWR	0643-1KG
Grid prep holder	EMS	71175-01
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Hemacytometer	Fisher (SKC, Inc.)	22600100
HEPES	Fisher (ACROS Organics)	AC172572500
Hoechst 33342	ThermoFisher (Invitrogen)	H3570
Insulin	Fisher (Sigma Aldrich)	NC0520015
KCl	MP Bio	194844
KH2PO4	Fisher (ACROS Organics)	AC212595000
Leica-DMi8	Leica Microsystems		Can be customized with camera, stage, and objective attachments
Leonardo	Alvéole		https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade	Fisher (Supply Solutions)	50-100-3280
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	ThermoFisher (Invitrogen)	L3224
Microscope camera	Hammamatsu	C13440-20CU
Motorized stage	Märzhäuser Wetzlar	00-24-599-0000
NaCl	Fisher (Fisher BioReagents)	BP358-1
NaH2PO4	Fisher (ACROS Organics)	AC207802500
NaOH	Fisher (Alfa Aesar)	AAA1603736
PBS	Corning	21-040-CV
PDMS stencils	nanoscaleLABS	PDMS_STENCILS_EM	https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA	nanoscaleLABS	PEG-SVA-1GR	mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Penicillin	Fisher (Research Products International Corp)	50-213-641
pH strips	Fisher (Millipore Sigma)	M1095350001	pH probe can also be used
PLPP gel	nanoscaleLABS	PLPP-GEL-300UL	https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO	Alvéole		https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )	BEI Resources	NR-36460	https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grids	EMS (Quantifoil)	Q2100AR1	2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available
RPMI	Fisher (Lonza)	BW12-702F
RSV A2-mK+	see entry for pSynkRSV-19F	–	Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media	ThermoFisher (Gibco)	21720-024
SerialEM	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Straight tweezers	EMS (Dumont)	72812-D
Streptomycin	Fisher (Fisher BioReagents)	BP910-50
Sucrose	Avantor	4097-04
Tetracycline	Sigma	T8032-10MG
Titan Krios electron microscope	ThermoFisher		300kV, with direct electron detector camera and energy filter
Trypsin	ThermoFisher (Gibco)	15090046
Tube Revolver/Rotator	Fisher (Thermo Scientific)	11676341
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain	Bloomington Drosophila Stock Center	5146	http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html