Målet med denne protokollen er å lede celleadhesjon og vekst til målrettede områder av rutenett for kryo-elektronmikroskopi. Dette oppnås ved å påføre et anti-fouling lag som er ablated i brukerspesifiserte mønstre etterfulgt av avsetning av ekstracellulære matriseproteiner i de mønstrede områdene før cellesåing.
Helcellet kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er en kraftig teknologi som brukes til å produsere nanometernivåoppløsningsstrukturer av makromolekyler tilstede i cellulær kontekst og bevart i en nesten innfødt frossen-hydrert tilstand. Det er imidlertid utfordringer knyttet til å dyrke og/eller feste celler på TEM-rutenett på en måte som er egnet for tomografi, samtidig som cellene beholdes i sin fysiologiske tilstand. Her presenteres en detaljert trinnvis protokoll om bruk av mikropatterning for å lede og fremme eukaryotisk cellevekst på TEM-rutenett. Under mikropattering styres celleveksten ved å deponere ekstracellulære matriseproteiner (ECM) innenfor spesifiserte mønstre og posisjoner på folien til TEM-rutenettet, mens de andre områdene forblir belagt med et anti-begroingslag. Fleksibilitet i valg av overflatebelegg og mønsterdesign gjør mikropatterning bredt anvendelig for et bredt spekter av celletyper. Mikropatterning er nyttig for studier av strukturer i individuelle celler, samt mer komplekse eksperimentelle systemer som vertspatogeninteraksjoner eller differensierte multi-cellulære samfunn. Mikropattering kan også integreres i mange nedstrøms hele celle cryo-ET arbeidsflyter, inkludert korrelativt lys og elektronmikroskopi (cryo-CLEM) og fokusert ionstråle fresing (cryo-FIB).
Med utvikling, ekspansjon og allsidighet av kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har forskere undersøkt et bredt spekter av biologiske prøver i en nesten innfødt tilstand fra makromolekylær (~ 1 nm) til høy (~ 2 Å) oppløsning. Enpartikkel kryo-EM og elektron diffraksjonsteknikker brukes best på rensede makromolekyler i henholdsvis løsning eller i krystallinsk tilstand. Mens kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er unikt egnet for nesten innfødte strukturelle og ultrastrukturelle studier av store, heterofile gjenstander som bakterier, pleomorfiske virus og eukaryote celler3. I cryo-ET innhentes tredimensjonal (3D) informasjon ved å fysisk vippe prøven på mikroskopstadiet og skaffe seg en serie bilder gjennom prøven i forskjellige vinkler. Disse bildene, eller vippeseriene, dekker ofte et område på +60/-60 grader i trinn på én til tre grader. Tilt-serien kan deretter rekonstrueres til et 3D-volum, også kjent som et tomogram4.
Alle cryo-EM-teknikker krever at prøven bygges inn i et tynt lag med amorf, ikke-krystallinsk, glassaktig is. En av de mest brukte kryofikseringsteknikkene er dykkfrysing, hvor prøven påføres EM-rutenettet, blottet og raskt dyppet i flytende etan eller en blanding av flytende etan og propan. Denne teknikken er tilstrekkelig for vitrifisering av prøver fra <100 nm til ~ 10 μm i tykkelse, inkludert dyrkede menneskelige celler, for eksempel HeLa-celler5,6. Tykkere prøver, som miniorganoider eller vevsbiopsier, opptil 200 μm i tykkelse, kan vitrifiseres ved høytrykksfrysing7. På grunn av økt elektronspredning av tykkere prøver er imidlertid prøve- og istykkelsen for kryo-ET begrenset til ~ 0,5 – 1 μm i 300 kV overføringselektronmikroskop. Derfor er helcellet kryo-ET av mange eukaryote celler begrenset til celleperikodeien eller utvidelser av celler med mindre ytterligere prøveforberedelsestrinn brukes, for eksempel kryo-seksjonering8 eller fokusert-ion-stråle fresing9,10,11.
En begrensning av mange kryo-ET-bildeeksperimenter i hele celler er datainnsamlingsgjennomstrømming12. I motsetning til en-partikkel cryo-EM, hvor tusenvis av isolerte partikler ofte kan avbildes fra en enkelt TEM rutenett firkant, celler er store, spredt ut, og må dyrkes med lav nok tetthet til at cellene kan bevares i et tynt lag av glassaktig is. Interesseområdet er ofte begrenset til en bestemt funksjon eller et bestemt underområde i cellen. Ytterligere begrensende gjennomstrømning er cellenes tilbøyelighet til å vokse på områder som ikke er mottagelige for TEM-avbildning, for eksempel på eller i nærheten av TEM-rutenettstenger. På grunn av uforutsigbare faktorer knyttet til cellekultur på TEM-nett, er det nødvendig med teknologisk utvikling for å forbedre utvalgets tilgjengelighet og gjennomstrømning for datainnsamling.
Substratmikropattering med adherent ekstracellulære matriseproteiner (ECM) er en veletablert teknikk for levende cellelysmikroskopi for å lede veksten av celler på stive, holdbare og optisk gjennomsiktige overflater som glass og andre vevskultursubstrater13,14. Mikropattering er også utført på myke og/eller tredimensjonale (3D) overflater. Slike teknikker har ikke bare tillatt for presis plassering av celler; de har også støttet opprettelsen av multicellulære nettverk, for eksempel mønstrede nevrale cellekretser15. Å bringe mikropatterning til cryo-ET vil ikke bare øke gjennomstrømningen, men det kan også åpne opp nye studier for å utforske komplekse og dynamiske cellulære mikromiljø.
Nylig har flere grupper begynt å bruke mikropatterningsteknikker på TEM-rutenett gjennom flere tilnærminger16,17. Her beskrives bruken av en maskerløs fotopatteringsteknikk for TEM-rutenett ved hjelp av Alvéole PRIMO mikropatterningssystem, som har høy oppløsning og kontaktløs mønster. Med dette mikropatteringssystemet påføres et anti-fouling-lag på toppen av substratet, etterfulgt av påføring av en fotokaalyst og ablasjon av anti-fouling laget i brukerdefinerte mønstre med en UV-laser. ECM-proteiner kan deretter legges til mønstrene for riktig cellekultur. Denne metoden har blitt brukt av flere grupper for kryo-ET-studier av retinal pigment epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby hunde nyre-II (MDCKII), human forhud fibroblast (HFF), og endotelcellelinjer16,17,18. Dette mikropatterningssystemet er kompatibelt med flere anti-fouling lag substrater samt enten en væske eller gel fotokatoklystrest reagens. En rekke ECM-proteiner kan velges fra og tilpasses spesifiktheten til cellelinjen, noe som gir allsidighet for brukeren.
Mikropattering har blitt brukt på en rekke prosjekter innen laboratoriet19. Her presenteres en mikropatterningsprotokoll, inkludert spesifikke tilpasninger for å studere dyrkede HeLa-celler, respiratorisk synytialvirus (RSV)-infiserte BEAS-2B-celler og primære larval Drosophila melanogaster neurons20.
Moderne, avanserte elektronmikroskoper og programvarepakker støtter nå strømlinjeformet automatisert kryo-EM- og cryo-ET-datainnsamling der hundrevis til tusenvis av stillinger kan målrettes og avbildes i løpet av få dager32,33,34,35. En betydelig begrensende faktor for kryo-ET-arbeidsflyter i hele cellen har vært å oppnå tilstrekkelig antall mål som kan samles inn per rutenett. Nylig har en rekke grupper utviklet protokoller for mikropatterning av rutenett for kryo-EM, med en fordel å forbedre datainnsamlingseffektiviteten16,17,18. Her presenteres en protokoll for bruk av et kommersielt tilgjengelig mikropatteringssystem til mikropattern TEM-rutenett for kryo-ET-studier av primære Drosophila-nevroner og kultiverte menneskelige cellelinjer (uinfisert eller RSV-infisert). Dette mikropatterningssystemet er allsidig, og mange trinn kan optimaliseres og skreddersys for å passe til spesifikke eksperimentelle mål. En bruker med TEM- og fluorescensmikroskopierfaring kan raskt bli dyktig i nettforberedelse og mikropattering. Med forsiktig praksis bør gode resultater oppnås etter noen gjentakelser. Nedenfor diskuteres noen av alternativene som er tilgjengelige, brukerhensyn, potensielle fordeler og fremtidige anvendelser av mikropattering for cryo-EM.
En av de viktige hensynene for hele celle cryo-ET er EM rutenettvalg. EM-gitter består av to deler: en maskeramme (eller strukturell støtte) og folien (eller filmen), som er den kontinuerlige eller hullete filmoverflaten som cellene vil vokse på. Kobbernettgitter brukes ofte til kryo-EM av proteiner og isolerte komplekser. Imidlertid er de uegnet for hele celle cryo-ET på grunn av cytotoksisiteten til kobber. I stedet brukes et gullnett ofte til cellulær tomografi. Andre alternativer inkluderer nikkel eller titan, som kan gi fordeler over gull som økt stivhet16. EM-rutenett er tilgjengelige med forskjellige maskedimensjoner for å støtte en rekke applikasjoner. Større maskestørrelser gir mer plass til celler å vokse mellom rutenett og flere områder som er egnet for vippeseriesamling, men på bekostning av økt generell prøveskjørhet. Den mest brukte folien er perforert eller hullete amorf karbon, for eksempel Quantifoils eller C-flate gitter. Biologiske mål kan avbildes enten gjennom hullene i karbonet eller gjennom det elektron-gjennomskinnelige karbonet. Gitter som R 2/1 eller R 2/2, der hullene er 2 μm brede som er henholdsvis 1 og 2 μm fra hverandre, gir et stort antall hull og dermed et stort antall potensielle områder for datainnsamling. Noen celler kan imidlertid vokse og ekspandere bedre på mer ensartede overflater som R 1.2/20 rutenett eller kontinuerlig karbon. For nedstrøms prøvebehandling ved fokusert ionstrålefresing (cryo-FIB) fjernes folien gjennom fresing, noe som reduserer bekymringene over den underliggende filmens fortsatte tilstedeværelse. Som med masken er folier fra andre materialer også tilgjengelige, med mønsterprotokollen presentert her som like egnet for SiO2-rutenett . Vanlige rutenett inkluderer gull Quantifoil, kontinuerlig karbon, eller SiO2 film 200-mesh rutenett (~ 90 μm avstand mellom rutenettstenger) for hele celle cryo-ET.
Det er en rekke hensyn å ta når du utformer et mønster. Et flertall av disse beslutningene styres av celletypen og formålet med eksperimentet. Et godt utgangspunkt er å velge et mønster som tilnærmer seg formen og dimensjonene til cellene i kulturen. Mange studier har vist signifikante effekter av mønsterform på cellevekst og cytoskeletal arrangement13,36,37. Spesiell forsiktighet bør tas under mønsterdesign hvis dette kan endre målet for interesse. Flere mønstre for hver celletype ble testet for å bestemme hvilke mønstre som fremmet cellulær vedheft og vekst. Fleksibiliteten til mikropatterningssystemet tillater testing av flere mønstre på et enkelt rutenett og endrede mønstre for forskjellige rutenett i et enkelt eksperiment. Større mønstre (~50-90 μm), for eksempel de som brukes her, øker sannsynligheten for at flere celler holder seg til ett enkelt område av mønsteret og lar cellene utvide seg og strekke seg etter vedheft. Mer begrensede mønstre (20-30 μm) kan være hensiktsmessige i eksperimenter der celleisolasjon er mer kritisk enn celleutvidelse, for eksempel for eksperimenter med stråle fresing (cryo-FIB). For tomografiapplikasjoner kan det hende man må vurdere virkningen av vippeaksen. Hvis et mønster er plassert slik at alle celler vokser parallelt med hverandre i en enkelt retning, er det mulig at alle cellene vil være vinkelrett på vippeaksen når de lastes inn i mikroskopstadiet, noe som resulterer i en lavere kvalitet på data.
På uberørte rutenett holder celler seg ofte fortrinnsvis til rutenettlinjene, der de ikke kan avbildes av TEM. Selv på mønstrede rutenett observeres celler ofte å være plassert i hjørnene av rutenett firkanter delvis på både mønstret karbonfolie og rutenettstang. Nylig ble mikropatterning brukt til å bevisst plassere en del av cellen over rutenettet bar18. Dette kan vurderes for eksperimenter der det ikke er kritisk å ha hele celleperiphery på folien. Dette kan være spesielt viktig for celler som kan bli større enn en enkelt rutenetts firkant, for eksempel primære nevroner som vokser over flere dager.
Det er mange verktøy som kan brukes til å designe et mønster. Her var mønsteret begrenset til mindre enn 800 piksler i en hvilken som helst dimensjon, slik at mønsteret kan roteres til en hvilken som helst vinkel og fortsatt passe innenfor det maksimale området som kan mønstres i en enkelt projeksjon av dette mikropatterningssystemet. Dette gjør at brukeren kan rotere mønsteret slik at det er riktig orientert med rutenettet uavhengig av retningen på rutenettet på mikroskopet. Her ble rutenettet delt inn i seks mønsterområder. Dette gjør det først og fremst mulig å justere fokus mellom ulike områder i rutenettet. Spesielt gullgitter er veldig formbare og kan ikke legge seg helt flatt på glasset. Riktig fokus er avgjørende for rene, raffinerte mønsterresultater. Ved å bruke segmenterte mønstre må det bare foretas mindre justeringer i mønsterposisjonen hvis rutenettet skifter litt under mønsterprosessen, selv om dette vanligvis ikke er et problem når du bruker PLPP-gelen med PDMS-sjablongene. Til slutt forble de sentrale fire rutenettplassene i rutenettet uberørt. Dette støtter en bruker som tydelig kan identifisere midten av rutenettet, noe som er veldig nyttig for korrelative bildebehandlingsforsøk.
Mønsterprogramvaren for dette mikropatterningssystemet, Leonardo, har også mer avanserte funksjoner som søm og muligheten til å importere mønstre som PDF-filer, som er utenfor omfanget av denne protokollen. Denne programvaren inkluderer også mikrostrukturdeteksjon og automatisert mønsterposisjonering som kan brukes på TEM-rutenett. Denne funksjonen er mest nyttig når rutenettet er veldig flatt og kan mønstres uten å måtte justere fokus mellom forskjellige områder.
Valg av et ECM-protein kan ha en betydelig innvirkning på celleadhesjon og ekspansjon. Noen celler er kjent for å gjennomgå fysiologiske endringer når de vokser på spesifikke substrater38. Flere ECM-proteiner og konsentrasjoner ble testet for alle nye celletyper basert på tidligere arbeid rapportert i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin og kollagen er mye brukt til dyrkede celler og kan brukes som utgangspunkt hvis andre data ikke er tilgjengelige. Imidlertid må andre ECM-proteiner også vurderes hvis de ofte brukte ECM-proteinene ikke gir riktige tilslutningsegenskaper for cellene. Dette gjaldt spesielt for primære Drosophila-nevroner , da en høy konsentrasjon av plantens lectin concanavalin A var nødvendig for riktig cellulær overholdelse. Kompatibiliteten til cellulær vedheft og vekst med ECM kan testes ved å mønstre på glassretter eller lysbilder før overgangen til TEM-rutenett. Denne pre-screening tilnærmingen er tid og kostnadseffektiv hvis et stort antall kombinasjoner må undersøkes. Inkluderingen av et fluorescerende konjugert ECM-protein er verdifullt for å vurdere suksess og kvalitet på mønster.
Cellesåing er et av de viktigste trinnene for hele celle cryo-ET, enten med eller uten mikropatterning6,16,39. For primære Drosophila eller andre nevroner, som er skjøre, ustabile i suspensjon, og kan være begrenset i mengde, foretrekkes enkeltsåingsmetoder fremfor overvåket, sekvensiell cellesåing. Et enkelt såingstrinn med en optimalisert celletetthet, som beskrevet i protokollen for Drosophila-nevroner, er et levedyktig alternativ for de fleste celletyper. Det er imidlertid også mulig å frø celler på substratet ved en lavere innledende konsentrasjon og legge til flere celler på en overvåket måte som beskrevet her og i annen litteratur18. Denne sekvensielle såingen kan gi mer konsistente resultater i noen tilfeller. I likhet med standard cellekultur, bør det alltid tas hensyn til å opprettholde celle levedyktighet og minimere cellekumping under isolasjon.
Når du først starter med mikropatterning, er det noen få potensielle fallgruver som er skadelige for sluttresultatet. Forsiktig netthåndtering og steril teknikk, en jevn fordeling av PLPP gel, riktig dose og fokus under mønster, og vedlikehold av celle levedyktighet før såing er blant de viktigste hensynene for suksess. En liste over noen av de potensielle problemene samt løsningene ble satt sammen i tabell 1.
Mikropatterned rutenett kan brukes til å posisjonere celler for å etablere en konsekvent celletetthet over rutenettet og for å plassere områder av interesse i områder som passer for tilt-serie samling16,18. Plassering og posisjonering av celler kan brukes som fiducial markører for korrelasjon i kryo-CLEM-eksperimenter, noe som reduserer behovet for skjøre søkergitter og fluorescerende fiducial markører. Det skal imidlertid bemerkes at slike fiducial markører fortsatt kan være nyttige for submikrometernøyaktighetskorrelasjon29,40. Videre er en jevn fordeling av isolerte celler også svært gunstig for fokusert ionstråle fresing (cryo-FIB) eksperimenter for å maksimere antall celler hvor lamell kan kuttes16.
Tillegg av mikropatterning til cryo-EM-arbeidsflyter vil resultere i målbare forbedringer i datagjennomstrømning og potensielt muliggjøre nye eksperimenter. Etter hvert som teknikken blir videre tatt i bruk og utviklet, vil mer avanserte anvendelser av mikropatterning inkludert ECM-gradienter, flere ECM-avsetninger og mikrostrukturmontering ytterligere utvide egenskapene til kryo-ET for å studere biologiske mål og prosesser i full cellulær kontekst.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang og Mrs. Josephine W. Mitchell i Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison for sjenerøst å dele elav-Gal4, UAS-CD8::GFP flystamme (Bloomington stock center, #5146). Vi vil også takke Dr. Aurélien Duboin, Mr. Laurent Siquier og Ms. Marie-Charlotte Manus fra Alvéole og Mr. Serge Kaddoura fra Nanoscale Labs for deres generøse støtte under dette prosjektet. Dette arbeidet ble delvis støttet av University of Wisconsin, Madison, Institutt for biokjemi ved University of Wisconsin, Madison og folkehelsetjenesten gir R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 og U24 GM139168 til E.R.W. og R01 AI150475 til P.W.S. fra NIH. En del av denne forskningen ble støttet av NIH grant U24 GM129547 og utført ved PNCC ved OHSU og åpnet gjennom EMSL (grid.436923.9), et DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research. Vi er også takknemlige for bruken av fasiliteter og instrumentering ved Cryo-EM Research Center ved Institutt for biokjemi ved University of Wisconsin, Madison.
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | |
0.22 µm syringe filters PVDF membrane | Genesee | 25-240 | |
22×60-1 Glass cover slip | Fisher | 12545F | |
5/15 Tweezers | EMS (Dumont) | 0203-5/15-PO | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher (Gibco) | 15240096 | |
BEAS-2B cells | ATCC | CRL-9609 | |
Collagen I, bovine | ThermoFisher (Gibco) | A1064401 | |
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | C11254 | |
DMEM | Fisher (Lonza) | BW12-604F | |
EtOH | Fisher (Decon Labs) | 22-032-600 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | F35200 | |
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher (Gibco) | 33010018 | |
Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Glucose | VWR | 0643-1KG | |
Grid prep holder | EMS | 71175-01 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
Hemacytometer | Fisher (SKC, Inc.) | 22600100 | |
HEPES | Fisher (ACROS Organics) | AC172572500 | |
Hoechst 33342 | ThermoFisher (Invitrogen) | H3570 | |
Insulin | Fisher (Sigma Aldrich) | NC0520015 | |
KCl | MP Bio | 194844 | |
KH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC212595000 | |
Leica-DMi8 | Leica Microsystems | Can be customized with camera, stage, and objective attachments | |
Leonardo | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/ | |
Liberase Research Grade | Fisher (Supply Solutions) | 50-100-3280 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | ThermoFisher (Invitrogen) | L3224 | |
Microscope camera | Hammamatsu | C13440-20CU | |
Motorized stage | Märzhäuser Wetzlar | 00-24-599-0000 | |
NaCl | Fisher (Fisher BioReagents) | BP358-1 | |
NaH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC207802500 | |
NaOH | Fisher (Alfa Aesar) | AAA1603736 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
PDMS stencils | nanoscaleLABS | PDMS_STENCILS_EM | https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/ |
PEG-SVA | nanoscaleLABS | PEG-SVA-1GR | mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 |
Penicillin | Fisher (Research Products International Corp) | 50-213-641 | |
pH strips | Fisher (Millipore Sigma) | M1095350001 | pH probe can also be used |
PLPP gel | nanoscaleLABS | PLPP-GEL-300UL | https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/ |
PRIMO | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/ | |
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) | BEI Resources | NR-36460 | https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx |
Quantifoil grids | EMS (Quantifoil) | Q2100AR1 | 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available |
RPMI | Fisher (Lonza) | BW12-702F | |
RSV A2-mK+ | see entry for pSynkRSV-19F | – | Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F |
Schneider's Media | ThermoFisher (Gibco) | 21720-024 | |
SerialEM | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | |
Straight tweezers | EMS (Dumont) | 72812-D | |
Streptomycin | Fisher (Fisher BioReagents) | BP910-50 | |
Sucrose | Avantor | 4097-04 | |
Tetracycline | Sigma | T8032-10MG | |
Titan Krios electron microscope | ThermoFisher | 300kV, with direct electron detector camera and energy filter | |
Trypsin | ThermoFisher (Gibco) | 15090046 | |
Tube Revolver/Rotator | Fisher (Thermo Scientific) | 11676341 | |
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain | Bloomington Drosophila Stock Center | 5146 | http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html |