הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי
Summary
פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.
Abstract
הידבקות מתגלגלת, הקלה על ידי אינטראקציות בתיווך סלקטיבי, היא תנועתיות דינמית מאוד, פסיבית בגיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. תופעה זו מתרחשת venules postcapillary, שבו זרימת הדם דוחפת לויקוציטים בתנועה מתגלגלת על תאי האנדותל. גלגול יציב דורש איזון עדין בין היווצרות קשר הידבקות לבין הניתוק המכני שלהם, ומאפשר לתא להישאר מחובר לפני השטח תוך כדי גלגול לכיוון הזרימה. שלא כמו תהליכי הידבקות אחרים המתרחשים בסביבות סטטיות יחסית, הידבקות מתגלגלת היא דינמית מאוד כאשר התאים המתגלגלים נעים על פני אלפי מיקרון בעשרות מיקרון לשנייה. כתוצאה מכך, שיטות מכניות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה אינם מתאימים למדידת אירועי הידבקות בודדים ואת הכוחות המולקולריים הקשורים בשל ציר הזמן הקצר ורגישות גבוהה הנדרשים. כאן, אנו מתארים את היישום האחרון שלנו של טביעת הרגל הידבקות assay כדי לדמיין את P-selectin: אינטראקציות PSGL-1 בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. שיטה זו משתמשת רצועות מד מתח מבוססות DNA בלתי הפיכות כדי לייצר היסטוריה קבועה של אירועי הידבקות מולקולרית בצורה של מסלולי פלואורסצנטיות. ניתן לדמיין מסלולים אלה בשתי דרכים: (1) תפירת אלפי תמונות מוגבלות עקיפה כדי לייצר שדה ראייה גדול, המאפשרת הפקת טביעת רגל של הידבקות של כל תא מתגלגל לאורך אלפי מיקרון, (2) ביצוע DNA-PAINT כדי לשחזר תמונות ברזולוציית-על של מסלולי הפלואורסצנטיות בתוך שדה ראייה קטן. במחקר זה, נעשה שימוש ב-90% מטביעת הרגל של הידבקות כדי לחקור תאי HL-60 המתגלגלים בלחצי גיסה שונים. בעשותנו כן, הצלחנו לדמיין את ההתפלגות המרחבית של P-selectin: אינטראקציית PSGL-1 ולקבל תובנה על הכוחות המולקולריים שלהם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היסודות לחקירה כמותית של אינטראקציות פני התא השונות המעורבות בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית.
Introduction
מפל ההדבקה המתגלגל מתאר כיצד תאים במחזור לקשור ולהתגלגל לאורך קיר כלי הדם1. גלגול פסיבי הוא בעיקר בתיווך selectins, מחלקה עיקרית של מולקולות הידבקות הסלולר (CAMs)1. תחת זרם הגיזה של דם, לויקוציטים המבטאים P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) יוצרים קשרים ארעיים מאוד עם P-selectin, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי על פני השטח של תאי אנדותל מודלקים. תהליך זה הוא קריטי עבור לויקוציטים לעבור לאתר של דלקת2. בנוסף, PSGL-1 הוא גם קולטן mechanosensitive מסוגל להפעיל את שלב הידבקות המשרד הבאים של מפל הידבקות מתגלגל על מעורבותו עם P-selectin3.
מוטציות גנטיות המשפיעות על תפקוד CAM יכולות להשפיע קשות על המערכת החיסונית, כגון במחלה הנדירה של מחסור בהידבקות לויקוציטים (LAD), שבה תקלה במולקולות הידבקות המתווכות בגלגול מובילה לאנשים אימונו-מוגעים קשות4,5,6. בנוסף, תאים סרטניים במחזור הוכחו לנדוד בעקבות תהליך גלגול דומה, המוביל גרורות7,8. עם זאת, מכיוון שגלגול תאים הוא מהיר ודינמי, שיטות מכניות ניסיוניות קונבנציונליות אינן מתאימות לחקר אינטראקציות מולקולריות במהלך גלגול תאים. בעוד ששיטות מניפולציה של תאים יחידים ומולקולה אחת כמו מיקרוסקופיה של כוח אטומי ופינצטה אופטית הצליחו לחקור אינטראקציות מולקולריות כגון האינטראקציה התלויה בכוח של P-selectin עם PSGL-1 ברמת המולקולה הבודדת9, הן אינן מתאימות לחקירת אירועי הידבקות חיה במהלך גלגול תאים. בנוסף, האינטראקציה המאופיינת במבחנה אינה יכולה לענות ישירות על השאלה על הידבקות מולקולרית ב- vivo. לדוגמה, איזה טווח מתח מולקולרי רלוונטי מבחינה ביולוגית כאשר תאים מתפקדים בסביבתם הטבעית? שיטות חישוביות כגון סימולציית דינמיקה דבק10 או מודל מצב יציב פשוט11 לכדו פרטים מולקולריים מסוימים וכיצד הם משפיעים על ההתנהגות המתגלגלת אך תלויים מאוד בדיוק הפרמטרים וההנחות של המודל. טכניקות אחרות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה יכול לזהות כוחות במהלך נדידת תאים אבל לא מספקים רזולוציה מרחבית מספקת או מידע כמותי על מתח מולקולרי. אף אחת מהטכניקות הללו אינה יכולה לספק תצפיות ניסיוניות ישירות של הדינמיקה הזמנית, ההטרוגניות המרחבית וההטרוגניות בעוצמה של כוחות מולקולריים, המתייחסים ישירות לתפקוד התא ולהתנהגות בסביבתם הטבעית.
לכן, יישום חיישן כוח מולקולרי המסוגל למדוד במדויק אינטראקציות בתיווך סלקטיבי חיוני לשיפור הבנתנו של הידבקות מתגלגלת. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור טביעת הרגל הידבקות assay12 שבו חרוזים מצופים PSGL-1 מגולגלים על משטח המציג p-selectin פונקציונלי מד צמיגים (TGTs)13. TGTs אלה הם חיישני כוח מבוססי DNA בלתי הפיכים שגורמים להיסטוריה קבועה של אירועי קרע בצורה של קריאת פלואורסצנטיות. זה מושג באמצעות הקרע של TGT (dsDNA) ולאחר מכן תיוג לאחר מכן של TGT קרוע (ssDNA) עם גדיל משלימה תווית פלואורסצנטית. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא התאימות שלה הן להדמיה מוגבלת עקיפה והן עם רזולוציית-על. הגדיל המשלים המסומן באופן פלואורסצנטי יכול להיות מאוגד לצמיתות (>12 bp) להדמיה מוגבלת עקיפה או כבול באופן חולף (7-9 bp) להדמיה ברזולוציית-על באמצעות DNA PAINT. זוהי מערכת אידיאלית לחקור הידבקות מתגלגלת כמו TGTs נקרעים במהלך גלגול פעיל, אבל קריאת פלואורסצנטיות מנותח לאחר גלגול. שתי שיטות ההדמיה מספקות גם למשתמש יותר חופש לחקור הידבקות מתגלגלת. בדרך כלל, הדמיה מוגבלת עקיפה שימושית לחילוץ כוח קרע מולקולרי באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות13, ואילו הדמיה ברזולוציית-על מאפשרת ניתוח כמותי של צפיפות הקולטן. עם היכולת לחקור תכונות אלה של הידבקות מתגלגלת, גישה זו מספקת פלטפורמה מבטיחה להבנת מנגנון ויסות הכוח על הידבקות מולקולרית של תאים מתגלגלים תחת זרימת גיסת.
Protocol
Representative Results
Discussion
טביעת הרגל של הידבקות מאפשרת הדמיה של אירועי הידבקות מולקולרית בין PSGL-1 ו- P-selectin במהלך הידבקות מתגלגלת תאים. תהליך זה מופעל על ידי לכידה בתיווך P-selectin ואחריו מתגלגל תחת לחץ גיזום נוזלי. בעיות פוטנציאליות במהלך הניסוי כרוכות בדרך כלל גלגול תאים עניים או חסר מסלולי פלורסנט גם כאשר תאים מתגלגל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות (CFI 35492), המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה דיסקברי גרנט (RGPIN-2017-04407), גבולות חדשים בקרן המחקר (NFRFE-2018-00969), קרן מייקל סמית לחקר הבריאות (SCH-2020-0559) וקרן אמיליה הבריטית.
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules – Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
