Radiosíntese de 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-Triptofano usando um Protocolo de Dois Passos de Um pote e Duas etapas

Summary

Aqui, descrevemos a radiosíntese de 1-(2-[^18F]Fluoroetil)-L-triptofano, um agente de tomografia de emissão de pósitrons para estudar o metabolismo triptofano, usando uma estratégia de dois passos em um sistema de síntese radioquímica com bons rendimentos radioquímicos, alto excesso enantiomemérico e alta confiabilidade.

Abstract

A via kynurenine (KP) é uma rota primária para o metabolismo do triptofano. Evidências sugerem fortemente que os metabólitos do KP desempenham um papel vital na proliferação de tumores, epilepsia, doenças neurodegenerativas e doenças psiquiátricas devido aos seus efeitos imunodemografados, neuro modulatórios e neurotóxicos. O agente de tomografia de emissão de pósitrons mais utilizado (PET) para mapear o metabolismo triptofano, α-[^11C]metil-L-triptofano ([^11C]AMT), tem uma meia-vida curta de 20 minutos com procedimentos de radiosíntese trabalhosos. Um ciclotron no local é necessário para radiosintthesize [^11C]AMT. Apenas um número limitado de centros produz [^11C]AMT para estudos pré-clínicos e investigações clínicas. Assim, o desenvolvimento de um agente de imagem alternativo que tenha uma meia-vida mais longa, favorável à cinética in vivo , e é fácil de automatizar é urgentemente necessário. A utilidade e o valor de 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano, um análogo triptofano de flúor-18, foi relatado em aplicações pré-clínicas em xenoenxertos derivados de linha celular, xenoenxertos derivados do paciente e modelos de tumor transgênicos.

Este artigo apresenta um protocolo para a radiosíntese de 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano usando uma estratégia de um pote e duas etapas. Usando este protocolo, o radiotracer pode ser produzido em um rendimento radioquímico de 20 ± 5% (decadência corrigida no final da síntese, n > 20) de produção radioquímica, com pureza radioquímica e excesso enantiomerico de mais de 95%. O protocolo apresenta uma pequena quantidade precursora com no máximo 0,5 mL de solvente de reação em cada etapa, baixa carga de 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicicclo[8.8.8]hexacosane (K222) e uma fase móvel ambientalmente benigna e injetável para purificação. O protocolo pode ser facilmente configurado para produzir 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano para investigação clínica em um módulo comercialmente disponível.

Introduction

Em humanos, o triptofano é um componente essencial da dieta diária. O triptofano é principalmente metabolizado através da via kynurenine (KP). O KP é catalisado por duas enzimas limitantes de taxa, indoleamina 2, 3-dioxygenase (IDO) e triptofano 2, 3-dioxygenase (TDO). Mais de 95% do triptofano é convertido em kynurenine e seus metabólitos a jusante, gerando, em última análise, dinucleotídeo de nicotinamida adenina, essencial para a transdução de energia celular. O KP é um regulador chave do sistema imunológico e um importante regulador de neuroplasticidade e efeitos neurotóxicos1,2. O metabolismo anormal do triptofano está implicado em vários distúrbios neurológicos, oncológicos, psiquiátricos e metabólicos; portanto, os análogos de triptofano radiolabeled têm sido amplamente utilizados na investigação clínica. Os dois radiotratores triptofanos clinicamente mais procurados clinicamente são 11C-α-metil-L-triptofano ([^11C]AMT) e ^{11C-5-hidroxitryptophan} (^11C-5-HTP)3.

Na década de 1990, ^{o 11C-5-HTP} foi usado para visualizar tumores neuroendócrinos que secretam ^serotonina4 e para diagnosticar e monitorar a terapia de adenocarcinoma prostático-refratária metastática. Posteriormente, foi utilizado como ferramenta de imagem para a quantificação do sistema serotonérgico no pâncreas endócrino6. ¹¹ C-5-HTP também tem sido um rastreador promissor para a detecção não invasiva de ilhotas viáveis no transplante de ilhotas intraportais e diabetes tipo ^27,8. Nas últimas duas décadas, muitos aminoácidos radiolabelados avançaram para a investigação ^clínica9,10. Em particular, o análogo triptofano com rótulo carbono 11 [^11C]AMT recebeu ampla atenção para o mapeamento da síntese de serotonina cerebral11,12,13,14 e para localização de focos epilépticos, tumores epieptogênicos, complexo de esclerose tuberosa, gliomas e câncer de mama15,16,17, 18,19,20 ⁽21,22,23,24,25,26). [^11C] A AMT também tem alta absorção em vários tumores de baixo e alto grau em ^crianças27. Além disso, a análise do rastreador cinético de [^11C]AMT em indivíduos humanos tem sido usada para diferenciar e classificar vários tumores e diferenciar glioma da lesão tecidual induzida por ^radiação15. [^11C] A imagem guiada pela AMT mostra benefícios clínicos significativos em distúrbios ^{cerebrais3,25}. No entanto, devido à curta meia-vida de carbono-11 (20 min) e aos procedimentos laboriosos de radiosíntese, o uso [^11C]AMT é restrito aos poucos centros PET com um ciclotron no local e uma instalação de radioquímica.

A flúor-18 tem uma meia-vida favorável de 109,8 min, em comparação com a meia-vida de 20 min de carbono-11. Cada vez mais, os esforços têm sido focados no desenvolvimento de radiotracers com rótulo flúor-18 para o metabolismo triptofano3,28. Um total de 15 radiofatores triptofanos de flúor únicos-18 foram relatados em termos de radiolabeling, mecanismos de transporte, estabilidade in vitro e in vivo, biodistribução e absorção de tumores em xenoenxertos. No entanto, a rápida defluorinação in vivo foi observada para vários rastreadores, incluindo 4-, 5-, e 6-[^18F]fluorotryptophan, impedindo a tradução clínica ^posterior29. 5-[^18F]Fluoro-α-metiltrofano (5-[^18F]FAMT) e 1-(2-[^18F]fluoroethyl)-L-triptofano (L-[^18F]FETrp, também conhecido como (S)-2-amino-3-(1-(2-[^18F]fluoroetila)-1S-indol-3-yl)ácido propanoico, peso molecular 249,28 g/mole), são os dois radiotracers mais promissores com cinética viva em modelos animais e grande potencial para superar [¹¹ C]AMT para avaliação de condições clínicas com metabolismo deptofano ^{desregulado28}. 5-[^18F]FAMT mostrou alta absorção em xenoenxertos tumorais ido1 positivos de camundongos imunocomprometidos e é mais específico para a imagem do KP do que [^11C]AMT28,30. No entanto, a estabilidade in vivo de 5-[^18F]FAMT continua sendo uma preocupação potencial, uma vez que nenhum dado de defluorização in vivo foi relatado além de 30 min após a injeção do tracer30.

Um estudo pré-clínico em um modelo de camundongos de meduloblastoma geneticamente modificado mostrou que, quando comparado com a fluorodeoxyglucose ^{18F-fluorodeoxyglucose} (18F-FDG), L-[^18F]FETrp teve alto acúmulo em tumores cerebrais, defluorina in vivo insignificante e baixa absorção de fundo, demonstrando uma proporção de alvo-não-alvo ^{superior31,32}. Estudos de dosimetria de radiação em camundongos indicaram que o L-[^18F]FETrp tinha uma exposição de dosimetria favorável aproximadamente 20% menor do que o rastreador PET 18F-FDG ^18F-FDG33. De acordo com os achados de outros pesquisadores, os dados pré-clínicos do estudo fornecem evidências substanciais para apoiar a tradução clínica de L-[^18F]FETrp para a investigação de metabolismo anormal de triptofanos em humanos com distúrbios cerebrais como epilepsia, neuro-oncologia, autismo e esclerose tuberosa28,31,32,33,34,35,36 . Uma comparação geral entre os três rastreadores mais amplamente investigados para o metabolismo do triptofano, 11C-5-HTP, [^11C]AMT e L-[^18F]FETrp, é mostrada na Tabela 1. Tanto ^{o 11C-5-HTP quanto o} AMT têm um curto meio-período e procedimentos de radiolabelação trabalhosos. Um protocolo para a radiosíntese de L-[^18F]FETrp usando uma abordagem de um pote e duas etapas é descrito aqui. O protocolo apresenta o uso de uma pequena quantidade de precursor de radiolabeling, um pequeno volume de solventes de reação, baixo carregamento de K222 tóxico, e uma fase móvel ambientalmente benigna e injetável para purificação e fácil formulação.

Protocol

ATENÇÃO: O protocolo envolve materiais radioativos. Qualquer dose adicional de materiais radioativos poderia levar a um aumento proporcional na chance de efeitos adversos à saúde, como o câncer. Os pesquisadores devem seguir as práticas de dose “tão baixas quanto razoavelmente alcançáveis” (ALARA) para orientar o protocolo de radiosíntese com proteção adequada na célula quente ou no capô do chumbo. Minimizar o tempo de contato direto, usar um escudo de chumbo e manter a distância máxima para qualquer etap…

Representative Results

O esquema de reação é mostrado na Figura 1. O radiolabeling inclui os seguintes dois passos: 1) a reação do precursor de radiolatos com [18F]fluoreto fornece o intermediário 18F, e 2) deproteção dos grupos tert-butyloxycarbonycarbonyl e tert-butil-protecting grupos no intermediário oferece o produto final L-[18F]FETrp. Ambas as etapas de reação continuam a 100 °C por 10 min. Antes de receber [18F<…

Discussion

Triptofano é um aminoácido essencial para os humanos. Desempenha um papel importante na regulação do humor, função cognitiva e comportamento. Os derivados de triptofano radiolabeled, particularmente os derivados de ^11C rotulados por carbono, têm sido extensivamente estudados devido ao seu papel único no mapeamento da síntese de ^{serotonina38,39}, detecção e classificação de ^tumores40, orientando a cirurgia de <sup cla…

Materials

[18F]Fluoride in [18O]H2O	PETNET Solutions Inc.	N/A
4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane	ACROS	291950010	Kryptofix 222 or K222, 98%
Acetic acid	ACROS	222142500	99.8%
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004	anhydrous, 99.8%
Agilent 1260 HPLC system	Agilent Technologies	Agilent 1260	Agilent 1260 series
Analytcial chiral HPLC column	Sigma-Aldrich	12024AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm
Carbon dioxide, 60 LBS	Airgas	REFR744R200S	99.99%
D-FETrp standard reference	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
Empty sterile vial	Jubilant HollisterStier	7515	20 mm closure, 10 mL
Ethanol	Decon Labs	2716	200 proof, USP grade. ≥99.9%
Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile	Fisher Scientific	09-720-3
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721	≥37%
Isopropanol	Decon Labs	8316	70%, sterile
L-[18F]FETrp radiolabeling precursor	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
L-FETrp standard reference	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
Light C8 cartridge	Waters	WAT036770	Sep-Pak  C8 plus light cartridge
Needle, 20 G x 1	Becton-Dickinson & Co.	305175
Needle, 20 G x 1 ½	Becton-Dickinson & Co.	305176
Needle, 21 G x 2	Becton-Dickinson & Co.	305129
Neutral aluminum oxide	Waters	WAT023561	Sep-Pak alumina N plus light
Nylon membrane (0.20 µm )	MilliPore	GNWP04700	47 mm
Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter	Pall Corporation	4907
PETCHEM radiochemistry synthesis system	PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI	N/A	Radiosynthesizer
pH strips 2.0 – 9.0	EMD Millipore	1.09584.0001
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	367877	99.995%
Quaternary methylammonium light cartridge	Waters	186004051	Sep-Pak QMA light
Semi-preparative C18 HPLC column	Phenomenex	00D-4253-N0	100 × 10 mm
Semi-preparative chiral HPLC column	Sigma-Aldrich	12034AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm
Sodium chloride injection 23.4%	APP Pharmaceutical, LLC	18730	USP grade
Sodium chloridei injection 0.9%	Hospira	NDC 0409-4888-10	USP grade
Sodium hydroxide	Honeywell	306576	99.99%
Spinal needle, 20 G x 3 ½	Becton-Dickinson & Co.	405182
Sterile alcohol prep pads	BioMed Resource Inc.	PC661
Sterile empty vials, 2 mL	Hollister Stier	7505ZA	13 mm closure
Sterile empty vials, 30 mL	Jubilant HollisterStier	7520ZA	20 mm closure
Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock	Air-Tite	4020-X00V0
Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock	Becton-Dickinson & Co.	309646
Syringe,  PP/PE, 10 mL, NORM-JECT	Air-Tite	4100-000V0
Syringe, 1 mL, Luer Slip	Becton-Dickinson & Co.	309659
Syringe, 3 mL, Luer-Lock	Becton-Dickinson & Co.	309657
Ultra high purity argon	Airgas	AR UHP300	99.999%
Ultrapure water	MilliporeSigma	ZRQSVP300	Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system