Summary
Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.
Abstract
Muchos laboratorios de biología celular de la retina ahora usan rutinariamente virus adenoasociados (AAV) para la edición de genes y aplicaciones regulatorias. La eficiencia de la transducción AAV suele ser crítica, lo que afecta los resultados experimentales generales. Uno de los principales determinantes para la eficiencia de transducción es el serotipo o variante del vector AAV. Actualmente, varios serotipos y variantes artificiales de AAV están disponibles con diferentes afinidades con los receptores de la superficie de la célula huésped. Para la terapia génica retiniana, esto resulta en diversos grados de eficiencia de transducción para diferentes tipos de células retinianas. Además, la ruta de inyección y la calidad de la producción de AAV también pueden afectar la eficiencia de la transducción de AAV retiniana. Por lo tanto, es esencial comparar la eficiencia de diferentes variantes, lotes y metodologías. El método de PCR digital de gotas (dd-PCR) cuantifica los ácidos nucleicos con alta precisión y permite realizar la cuantificación absoluta de un objetivo determinado sin ningún estándar o referencia. Utilizando dd-PCR, también es factible evaluar las eficiencias de transducción de los AV mediante la cuantificación absoluta de los números de copias del genoma AAV dentro de una retina inyectada. Aquí, proporcionamos un método sencillo para cuantificar la tasa de transducción de AAV en células de la retina utilizando dd-PCR. Con modificaciones menores, esta metodología también puede ser la base para la cuantificación del número de copias del ADN mitocondrial, así como para evaluar la eficiencia de la edición de bases, crítica para varias enfermedades de la retina y aplicaciones de terapia génica.
Introduction
Los virus adeno asociados (AVA) ahora se usan comúnmente para una variedad de estudios de terapia génica retiniana. Los AAV proporcionan una forma segura y eficiente de administración de genes con menos inmunogenicidad y menos integraciones del genoma. La entrada de AAV en la célula diana se produce a través de la endocitosis, que requiere la unión de receptores y co-receptores en la superficie celular1,2. Por lo tanto, la eficiencia de transducción de los AV para diferentes tipos de células depende principalmente de la cápside y sus interacciones con los receptores de la célula huésped. Los AAV tienen serotipos y cada serotipo puede tener tropismos celulares / tisulares distintos y eficiencias de transducción. También existen serotipos y variantes artificiales de AAV generados por modificación química de la cápside del virus, producción de cápsides híbridas, inserción de péptidos, barajado de la cápside, evolución dirigida y mutagénesis racional3. Incluso cambios menores en la secuencia de aminoácidos o la estructura de la cápside pueden influir en las interacciones con los factores de la célula huésped y dar lugar a diferentes tropismos4. Además de las variantes de la cápside, otros factores como la ruta de inyección y la variación de lote a lote de la producción de AAV pueden afectar la eficiencia de transducción de los AV en la retina neuronal. Por lo tanto, se necesitan métodos fiables para la comparación de las tasas de transducción para diferentes variantes.
La mayoría de los métodos para determinar la eficiencia de la transducción AAV se basan en la expresión génica del informador. Estos incluyen imágenes fluorescentes, inmunohistoquímica, western blot o análisis histoquímico del producto del gen reportero5,6,7. Sin embargo, debido a la restricción de tamaño de los AAV, no siempre es factible incluir genes reporteros para monitorear la eficiencia de la transducción. El uso de promotores fuertes como el potenciador híbrido cmV / beta-actina de pollo o el elemento regulador post-transcripcional de la hepatitis de Woodchuck (WPRE) como una secuencia estabilizadora de ARNm complica aún más el problema de tamaño8. Por lo tanto, también será beneficioso definir la tasa de transducción de los AV inyectados con una metodología más directa.
La PCR digital de gotas (dd-PCR) es una técnica poderosa para cuantificar el ADN objetivo a partir de cantidades diminutas de muestras. La tecnología dd-PCR depende de la encapsulación de la mezcla de reacción de ADN y PCR objetivo mediante gotas de aceite. Cada reacción dd-PCR contiene miles de gotas. Cada gota se procesa y analiza como una reacción PCR independiente9. El análisis de gotas permite calcular el número de copia absoluta de moléculas de ADN objetivo en cualquier muestra simplemente utilizando el algoritmo de Poisson. Dado que la eficiencia de transducción de los AAV se correlaciona con el número de copias de los genomas de AAV en la retina neuronal, utilizamos el método dd-PCR para cuantificar los genomas de AAV.
Aquí, describimos una metodología de dd-PCR para calcular la eficiencia de transducción de vectores AAV a partir de ADN genómico retiniano6,10. En primer lugar, los AAV que expresan tdTomato reporter se generaron utilizando el protocolo a pequeña escala, y se titularon mediante el método dd-PCR11. En segundo lugar, los AV se inyectaron intravítreamente en la retina neuronal. Para demostrar la eficiencia de la transducción, primero cuantificamos la expresión de tdTomato utilizando microscopía fluorescente y software ImageJ. Esto fue seguido por el aislamiento del ADN genómico para la cuantificación de genomas AAV en retinas inyectadas mediante dd-PCR. La comparación de los niveles de expresión de tdTomato con los genomas de AAV transducidos cuantificados por la dd-PCR mostró que el método de dd-PCR cuantificó con precisión la eficiencia de transducción de los vectores AAV. Nuestros protocolos demostraron una descripción detallada de una metodología basada en dd-PCR para cuantificar las eficiencias de transducción AAV. En este protocolo, también mostramos el número absoluto de genomas AAV que se transducen después de las inyecciones intravítreas simplemente utilizando el factor de dilución después del aislamiento genómico del ADN y los resultados de dd-PCR. En general, este protocolo proporciona un método poderoso, que sería una alternativa a la expresión reportera para cuantificar las eficiencias de transducción de los vectores AAV en la retina.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales fueron aceptados por el comité de ética de la Universidad de Sabanci y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la declaración de 'La Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología' para el uso de animales en la investigación.
1. Producción de AAV a pequeña escala12
- Cultivo de células HEK293T utilizando placas de 15 cm en 10 mL completos de DMEM/10% FBS hasta un 70-80% de confluencia.
- Preparar la mezcla de transfección con 20 μg de plásmido ayudante (pHGT1-Adeno1), 7 μg de plásmido cápside y 7 μg de vector AAV2-CBA-tdTomato-WPRE y 136 μL de solución de PEI (1 mg/mL) en 5 mL de DMEM.
- Añadir la mezcla de transfección preparada de 5 ml a una placa de cultivo celular que contenga 10 ml de medios de cultivo e incubar las células transfectadas durante 48-60 h a 37 °C.
- Recoger el medio a las 48-60 h post-transfección y digerirlo con DNasa I a una concentración final de 250 U/mL durante 30 min a 37 °C.
- Centrifugar el medio digerido a 4000 x g,4 °C durante 30 min y luego filtrarlo con un filtro de jeringa de 0,22 μm en la membrana de celulosa regenerada prehumedida durante 100 kDa.
- Centrifugar la membrana de celulosa regenerada a 4000 x g,4 °C durante 30 min y desechar el medio.
- Lavar y centrifugar la membrana de celulosa regenerada con PBS que contiene 0.001% Pluronic F-68 tres veces a 4000 x g,4 °C durante 30 min. Deseche el PBS en cada paso.
- Recoger AAV concentrados de la parte superior de la membrana de celulosa regenerada y alícuota para usos posteriores.
- Digiera 5 μL de AAV recién hecho con DNasa I (0.2U/μl) durante 15 min a 37 °C para la titulación. Esto es seguido por 10 min a 95 °C de incubación tanto para inactivar la DNasa I como degradar las cápsides virales.
- Prepare una dilución en serie de 10 veces a partir de AAV digeridos usando F-68 Plurónico al 0.05%. Utilice imprimaciones AAV2-ITR y WPRE para la valoración (Tabla 1). Los títulos se calcularon multiplicando los resultados de dd-PCR con los factores de dilución. Los resultados se convirtieron en copia del genoma/ml (GC/mL).
NOTA: Se espera que las concentraciones de AAV para la producción de AAV a pequeña escala sean de alrededor de 1 x10 12 GC / ml. Este protocolo no es aplicable para cepas AAV que no liberan AAV de manera eficiente en medios como AAV213.
2. Inyección intravítrea de AAV
-
Preparación de equipos
- Antes de comenzar, prepare una microjeringa de 10 μL con una aguja roma de 36 G. Enjuague cinco veces con 70% de EtOH, cinco veces en ddH2O, y finalmente cinco veces con PBS.
- Cargue la cantidad adecuada de AAV en la microjeringa para cada inyección.
- Prepare la aguja quirúrgica (sutura, seda, 6/0), cinta, fórceps y tijeras.
-
Inyección intravítrea
- Aplique 1 gota de tropicamida al 0,5% y clorhidrato de fenilefrina al 2,5% (por ejemplo, Mydfrin) que contenga gotas para los ojos antes de la anestesia para dilatar las pupilas.
- Anestesiar ratones con isoflurano al 5% (1 L/min) y continuar con isoflurano al 1,5% (1 L/min) durante el procedimiento. Se utiliza una pequeña cámara de isoflurano para la primera inducción.
- Verifique la profundidad de la anestesia por la pérdida del reflejo de enderezamiento, el reflejo de abstinencia y la respuesta de pellizco de la cola.
- Aplique tobramicina al 0,3% y solución oftálmica estéril de dexametasona al 0,1% en cada ojo antes del procedimiento de inyección. La aplicación de gotas para los ojos previene la sequedad y ejerce efectos antiinflamatorios y antibacterianos.
- Use el gancho quirúrgico para estabilizar el párpado superior. Tire ligeramente hacia atrás para exponer la parte dorsal del ojo. Pega el gancho con cinta adhesiva al banco para mantenerlo en su posición.
- Retire la conjuntiva (menos de 1 mm2)con las tijeras curvas del iris para exponer la esclerótica del ojo bajo el microscopio de disección. Use una jeringa de insulina fresca y estéril (30 G) para perforar la esclerótica.
- Inserte la aguja de la microjeringa a través de la misma punción utilizando un micromanipulador. Coloque la punta de la aguja detrás de la lente en el centro del ocular.
- Inyecte 1 μL de AAV2/BP2 y AAV2/PHP. Vectores S con concentraciones de 1,63 x10 12 GC/mL y 1,7 x10 12 GC/mL lentamente en el vítreo del ojo. El control del volumen de inyección se realiza manualmente. Deje la aguja en su lugar durante 1 minuto y retire lentamente la aguja.
- Suelte el párpado y aplique un tratamiento de gel tópico antiinflamatorio y antibacteriano que contenga tobramicina al 0,3% y dexametasona al 0,1% al ocular. Monitoree y evalúe a los ratones en los días siguientes de acuerdo con la hoja de puntuación en términos de apariencia (ojos brillantes, pelaje arreglado, encorvamiento), comportamiento (actividad, inmovilización, automutilación) y peso corporal en una escala de 0 a 3. Cada condición tiene una puntuación de 0-3 y una puntuación total de 3 o superior es un criterio de terminación.
- Coloque a los animales en la jaula después de la recuperación.
3. Imágenes de fluorescencia y fondo de ojo
- Colar el ratón y dilatar la pupila colocando gotas de 0,5% de tropicamida y 2,5% de clorhidrato de fenilefrina en cada ojo.
- Anestesiar al animal con el procedimiento anterior con isoflurano. Evalúe la profundidad de la anestesia cuidadosamente pellizcando las patas.
- Coloque el ratón en el escenario de imagen y verifique la dilatación adecuada comprobando a través de la cámara del fondo de ojo. Aplique gel tópico (carbómero 980 al 0,2%) sobre la superficie de los ojos para proteger los ojos de la deshidratación bajo anestesia y para usarlo como un gel de acoplamiento para imágenes.
- Manipule la etapa de imagen para alinearse con la pieza nasal del objetivo. Ajuste el escenario según sea necesario para centrar el ojo del ratón. Una vez que el ojo esté centrado, mueva lentamente el objetivo hasta que haga contacto con el ojo.
- Realizar imágenes de fondo de ojo y fluorescencia en ambos ojos para hacer un seguimiento de la expresión de tdTomato a la semana 1 semana y 2 semanas después de la inyección intravítrea (Figura 3B)14. Tome imágenes de fondo de ojo y fluorescencia en configuraciones idénticas para comparar la expresión del reportero.
4. Aislamiento de retina
- Eutanasia a los animales después de imágenes de fondo de ojo y fluorescencia por inhalación de CO2 para la recolección de retina en el punto de tiempo de 2 semanas.
- Desplace el globo ocular hacia adelante con la ayuda de una pinza divisora de 13,5 cm.
- Retire la lente junto con el vítreo sobrante aplicando una presión suave con las pinzas.
- Corte la conexión del globo ocular al nervio óptico con pinzas curvas de precisión y apriete suavemente la retina con las mismas pinzas curvas.
- Transfiera las retinas disecadas a un tubo de microcentrífuga.
- Congela la retina colocando los tubos en el nitrógeno líquido.
5. Aislamiento de ADN genómico tisular
- Aísle el ADN genómico con un kit de ADN genómico tisómico basado en la digestión proteinasa K comercializado.
- Digiera la retina a 55 °C, 200 x g durante 30 min con Proteinasa K, que ya se suministra en el kit.
- Realice el paso de incubación de RNasa, los pasos de lavado con tampón de lavado I y II, y finalmente el paso de elución de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Agregue un paso de centrifugado adicional después del último lavado para eliminar el etanol residual.
- Mida la concentración de ADN genómico y almacene las muestras a -20 °C.
6. Análisis de PCR digital de gotas de muestras de retina de ratón para cuantificación de genomas virales
- Diluir los ADN genómicos de las retinas inyectadas en solución Plurónica F-68 al 0,05% para alcanzar una concentración final de 1 ng/μL para cada muestra.
- Realice reacciones separadas para WPRE y 18S utilizando cebadores específicos del objetivo con una concentración final de 125 nM para cada imprimación.
- Realice la generación de gotas en una mezcla de reacción de PCR de 20 μL que incluye 1 ng de ADN genómico, 125 cebadores nM y 2x supermezcla evagreen.
- Cargue la mezcla de muestra en la parte central del cartucho para la generación de gotas.
- Después de realizar la carga de la muestra al cartucho, agregue 70 μL de aceite de generación de gotas en la fila inferior del cartucho.
- Coloque la junta en la parte superior del cartucho y colóquela en el generador de gotas. Asegúrese de que no haya espacio entre la junta y el cartucho.
- Tome suavemente aproximadamente 40 μL de gotas que se generan en el pozo superior. Agregue la solución de gotas a la placa de reacción de PCR semifalda de 96 pocillos.
- Selle la placa de PCR con sellador de placas de PCR utilizando papel de sellado de aluminio.
- Coloque la placa de PCR en un termociclador termosellado de 96 pocillos. Utilizar el protocolo PCR; 95 °C durante 5 min, 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min, 4 °C durante 5 min, 90 °C durante 5 min y 4 °C de retención infinita. Aplique una velocidad de rampa de 2 °C/s en cada ciclo para asegurarse de que las gotas alcancen la temperatura correcta para cada paso durante el ciclo
- Coloque la placa de PCR en el lector de gotas para cuantificar las gotas utilizando el software dd-PCR. Se configura una plantilla utilizando configuraciones específicas para evagreen.
- Analice los datos utilizando un gráfico de gráfico 1-D con cada muestra para la intensidad de fluorescencia frente al número de gotas. El valor umbral se organiza de modo que las gotas por encima del umbral se asignan como positivas y las inferiores como negativas. Esto es seguido por la aplicación del algoritmo de Poisson para determinar la concentración inicial de ADN objetivo en unidades de copias/μL. La relación de WPRE versus 18S se calcula para medir la eficiencia de transducción AAV.
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Representative Results
La producción de AAV a pequeña escala es un método rápido y eficiente que proporciona vectores para inyecciones intravítreas(Figura 1). La producción de AAV a pequeña escala generalmente da títulos dentro del rango de 1 x 1012 GC / ml, que es suficiente para detectar la expresión del reportero en la retina (Figura 2). La titulación de AAV mediante dd-PCR da resultados consistentes. Los cebadores específicos ITR2 y WPRE se utilizan rutinariamente y la concentración inicial de cada molécula objetivo se calculó con el software dd-PCR mediante el modelado como una distribución de Poisson. Los cálculos se finalizaron mediante la multiplicación de los factores de dilución y se convirtieron en copia del genoma por ml. Los AAV que se producen para este protocolo tenían títulos de 1.63 x 1012 GC/mL y 1.7x 1012 GC/ml para AAV2/BP2 y AAV2/PHP.S7,15,respectivamente. Para la comparación, se utilizaron constructos idénticos de expresión de tdTomato para ambas cepas. Inyectamos títulos aproximadamente iguales de AAV para la cuantificación de la eficiencia de transducción de AAV. Después de la inyección de 1 μL de las concentraciones antes mencionadas de AAV, se tomaron imágenes de animales en los puntos de tiempo de 1 semana y 2 semanas. Se utilizó un sistema de imágenes de fondo de ojo y fluorescencia tanto para AAV2/BP2 como para AAV2/PHP. S retinas inyectadas generando perfiles de expresión de reportero similares excepto para la retina #1 (Figura 3A,B). La expresión de TdTomato se cuantificó utilizando el software ImageJ para el valor gris promedio (intensidad media de fluorescencia) con el fin de comparar la eficiencia de transducción y la expresión del reportero(Figura 3A,B). Esta es básicamente la suma de los valores grises de todos los píxeles en la selección dividida por el número de píxeles16. Las imágenes fluorescentes de Retina # 1 mostraron solo una pequeña área de expresión de tdTomato, muy probablemente debido al reflujo o fuga después de las inyecciones intravítreas. De acuerdo con este hallazgo, la intensidad de fluorescencia de la retina # 1 fue de 0.9, que fue la más baja en comparación con todas las retinas que fueron inyectadas intravítreamente y fotografiadas. La intensidad media de fluorescencia estuvo entre 4 y 11. Esto mostró que la cuantificación de imágenes fluorescentes de expresión de tdTomato fue exitosa y se correlacionó con las imágenes que se mostraron(Figura 3A,B).
Después de la obtención de imágenes de retinas, el ADN genómico se aisló de las retinas inyectadas en el punto de tiempo de 2 semanas. La dd-PCR se realizó utilizando cebadores WPRE para la cuantificación del genoma AAV. El ratón 18S se utilizó para la normalización de los genomas AAV al genoma del ratón (Figura 3C)17. De acuerdo con la intensidad media de fluorescencia y las imágenes, la retina # 1 tenía un número de copias del genoma AAV muy bajo en relación con 18S, 0.011 veces más bajo en comparación con la retina # 2. Además, las retinas # 2, 3, 4 y 5 dan diferencias similares en el nivel del pliegue. Las diferencias de pliegues en comparación con la retina # 2 para las retinas # 3, 4 y 5 fueron de 1.75, 0.55 y 0.99, respectivamente. Entre ellos, la retina # 3 dio la mayor intensidad fluorescente y el número de copia del genoma AAV. Esto ya demostró que la cuantificación de genomas AAV transducidos con dd-PCR se correlaciona con la intensidad de fluorescencia y, por lo tanto, con la expresión de tdTomato que se observa. El método dd-PCR también nos permitió hacer una cuantificación absoluta de los AV transducidos. La cuantificación absoluta del genoma total de AAV por retina se calculó simplemente multiplicando el número total identificado a partir de dd-PCR y el factor de dilución para el ADN genómico. Esto arrojó resultados similares en comparación con la eficiencia de transducción del genoma AAV normalizada 18S (Figura 3D).
Figura 1: Diagrama de flujo de los procedimientos experimentales. La producción de AAV a pequeña escala es seguida por la titulación de AAV basada en dd-PCR. Los AAV se inyectan por vía intravítrea en la retina adulta. El seguimiento de los animales se realizó utilizando un fondo de ojo y un sistema de imágenes fluorescentes para analizar la expresión del reportero. El fondo de ojo y las imágenes fluorescentes se tomaron en puntos de tiempo de 1 semana y 2 semanas. El ADN genómico se aísla de las retinas inyectadas para su análisis con dd-PCR para cuantificar el genoma total de AAV que está presente en las retinas inyectadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Titulación de AAV utilizando el método dd-PCR. ( A )Elmétodo Dd-PCR se beneficia de las reacciones de PCR encapsuladas dentro de una gota. Después de la reacción de PCR utilizando la química evagreen, se analizaron gotas positivas y negativas para el gen objetivo para determinar el número absoluto de ADN objetivo dentro de una solución. (cajas rojas en gotas verdes). (B) Datos representativos de dd-PCR para la titulación de AAV. Varios lotes de AAV fueron titulados utilizando cebadores ITR2. Las gotas positivas y negativas se separan por encima y por debajo del umbral (línea púrpura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de genomas AAV transducidos en la retina por dd-PCR. Animales salvajes de 16 semanas de edad fueron inyectados intravítreamente con AAV2/BP2 y AAV2/PHP. Vectores S con concentraciones de 1,63 x10 12 GC/mL y 1,7x 1012 GC/mL, respectivamente. Ambos AAV tenían la misma construcción de expresión de tdTomato y el volumen de inyección para todos los AAV fue de 1 μL. Las retinas inyectadas (1-7) fueron seguidas con imágenes de fondo de ojo y fluorescencia. Las imágenes que se toman se cuantificaron utilizando el software Image J. A pesar de la diferencia de la cápside, todos los animales tenían un valor de intensidad media de fluorescencia(valor gris promedio)que oscilaba entre 4 y 11, excepto la retina # 1 que tenía la intensidad más baja, 0.9 y una expresión débil de tdTomato. Las columnas rojas y grises son AAV2/BP2 y AAV2/PHP. S retinas inyectadas, respectivamente (A-B). La dd-PCR se realizó utilizando cebadores WPRE para el genoma AAV y cebador 18S para la normalización en el punto de tiempo de 2 semanas. Retina # 1 también mostró números de copia AAV distintivamente más bajos por copias 18S(C). Los genomas totales de AAV por retina también se calcularon utilizando el número de copia WPRE y el factor de dilución para el aislamiento genómico del ADN(D). Los cuadrados rojos y grises son AAV2/BP2 y AAV2/PHP. S retinas inyectadas, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Imprimaciones ddPCR | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabla 1: secuencias de cebadores dd-PCR. Secuencias de cebadores hacia adelante y hacia atrás para WPRE, ITR2 y ratón 18S.
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Discussion
En este protocolo, generamos dos vectores AAV que tienen diferentes proteínas de cápside y luego los titulamos en consecuencia. Uno de los pasos más cruciales de este protocolo es producir cantidades suficientes de AAV que produzcan una expresión detectable del reportero después de la transducción12,13.
La titulación de los AAV también es un factor importante para ajustar las dosis de AAV para las inyecciones intravítreas. Una vez alcanzados estos importantes criterios, es factible cuantificar la eficiencia de transducción de los AVA mediante la metodología dd-PCR.
Muchos laboratorios están utilizando el método de PCR cuantitativa (qPCR) para la titulación de AAV. El método de cuantificación absoluta basado en qPCR requiere una curva estándar que tiene diluciones de cantidades conocidas de ADN objetivo18. Sin embargo, la dd-PCR no requiere una curva estándar, ya que cuantifica directamente el número total de moléculas diana dentro de una muestra dada mediante la detección de las gotas positivas que tienen al menos una copia del ADN objetivo. Dado que la dd-PCR es un análisis de punto final y no se requiere una curva estándar, los problemas de eficiencia que ocurrieron durante la reacción de qPCR son menos preocupantes para la dd-PCR como las PCR de baja eficiencia o la calidad de las curvas estándar 9. La metodología dd-PCR se puede aplicar a muestras que ya están preparadas para qPCR. Como ya se mencionó en la sección Métodos para la titulación de AAV, dd-PCR requiere muestras diluidas. Este es un paso crítico ya que la concentración de la muestra debe ajustarse de manera que haya suficientes gotas negativas para realizar el algoritmo de Poisson. En otras palabras, no es posible realizar la reacción dd-PCR con muestras con concentraciones demasiado altas de ADN objetivo que no producen gotas negativas.
Tanto para las mediciones de la eficiencia de titulación de AAV como de transducción, es posible utilizar diferentes conjuntos de objetivos. Para la titulación de AAV, utilizamos principalmente imprimaciones específicas de AAV2 ITR debido a la columna vertebral de AAV2 en nuestras construcciones. También es posible utilizar WPRE y otros objetivos específicos de genes dependiendo de la construcción AAV que se haya analizado.
Para evaluar la eficiencia de transducción de los AAV en la retina neuronal, aplicamos el método dd-PCR utilizando muestras de retina enteras para cuantificar la cantidad total de genomas de AAV por retina. Se evaluó la exactitud de la metodología mediante el uso de un vector AAV que expresa tdTomato reporter. Comparación de los resultados de dd-PCR con los niveles de expresión de tdTomato correlacionados excepto los dos valores atípicos. Las retinas # 6 y # 7 produjeron un exceso de copias del genoma AAV a pesar de mostrar intensidades de fluorescencia similares en comparación con las retinas # 2,3 4 o 5. Esto puede deberse a que estas retinas tienen tasas de transducción más altas con niveles de expresión limitados o pueden estar en parte relacionadas con partículas AAV duraderas o ADN vectorial dentro de la retina vítrea o neuronal19,20. En general, este fue el único factor limitante para nuestro método y se puede identificar fácilmente entre otras muestras. También cuantificamos el número total de genomas AAV por retina, que fue uno de los puntos fuertes de esta metodología. Esto permite la comparación de datos entre diferentes laboratorios y lotes de animales. Por lo tanto, este método se puede aplicar fácilmente para evaluar la eficiencia de transducción de un nuevo serotipo, variante o variación de lote a lote para vectores AAV que no tienen expresión de reportero y nos ayuda a comparar datos en diferentes configuraciones. Esto es crítico para los vectores AAV que no permiten la expresión de un reportero debido a restricciones de tamaño.
Este método también proporciona una base para otros tipos de ensayos sensibles que utilizan ADN objetivo. Usando los protocolos idénticos, podemos cuantificar los números de copias del genoma mitocondrial con los cebadores apropiados. También son posibles mejoras adicionales, incluida la disociación de la retina y los pasos de clasificación de citometría de flujo para cuantificar el ADN objetivo en células individuales o lotes de células. Además, también es factible evaluar la eficiencia de corrección de la edición de bases utilizando este método21,22, que también es crítico para varias enfermedades de la retina y terapias génicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Oezkan Keles, Josephine Jüttner y prof. Botond Roska, Instituto de Oftalmología Molecular y Clínica de Basilea, Complex Viruses Platform por su ayuda y apoyo para la producción de AAV. También nos gustaría agradecer al Prof. Jean Bennett, de la Escuela de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania por la cepa AAV8 /BP2. El trabajo con animales se realiza en las instalaciones de animales de la Universidad Técnica de Gebze. Por eso, agradecemos a Leyla Dikmetas y al Prof. Uygar Halis Tazebay por la asistencia técnica y el apoyo para la cría de animales. Fatma Ozdemir por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de TUBITAK, números de subvención 118C226 y 121N275, y la beca de integración de la Universidad de Sabanci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
