Спектрофотометрические методы исследования метаболизма эукариотического гликогена

Summary

Представлены методики измерения активности ключевых ферментов метаболизма гликогена с использованием простого спектрофотометра, работающего в видимом диапазоне.

Abstract

Гликоген синтезируется в качестве формы хранения глюкозы широким спектром организмов, начиная от бактерий и заканчивая животными. Молекула содержит линейные цепи α1,4-связанных остатков глюкозы с ветвями, вводимыми путем добавления α1,6-связей. Понимание того, как регулируется синтез и деградация гликогена и как гликоген достигает своей характерной разветвленной структуры, требует изучения ферментов хранения гликогена. Однако методы, наиболее часто используемые для изучения этих ферментных активностей, обычно используют реагенты или методы, которые доступны не всем исследователям. Здесь мы обсуждаем ряд процедур, которые технически просты, экономически эффективны и все же способны обеспечить ценную информацию о контроле хранения гликогена. Методы требуют доступа к спектрофотометру, работающему в диапазоне от 330 до 800 нм, и описаны при условии, что пользователи будут использовать одноразовые пластиковые кюветы. Тем не менее, процедуры легко масштабируются и могут быть изменены для использования в считывателе микропластин, что позволяет проводить высокопараллельный анализ.

Introduction

Гликоген широко распространен в природе, причем соединение содержится в бактериях, многих протистах, грибах и животных. В микроорганизмах гликоген важен для выживания клеток, когда питательные вещества ограничиваются, а у высших организмов, таких как млекопитающие, синтез и деградация гликогена служат для буферизации уровня глюкозы в крови ^1,2,3. Поэтому изучение метаболизма гликогена имеет важное значение для таких разнообразных областей, как микробиология и физиология млекопитающих. Понимание метаболизма гликогена требует изучения ключевых ферментов синтеза гликогена (гликогенсинтаза и фермент ветвления) и деградации гликогена (фосфорилаза гликогена и фермент деветривания). Анализы золотого стандарта гликогенсинтазы, фосфорилазы, ветвления и деветвирующего фермента используют радиоактивные изотопы. Например, гликогенсинтазу обычно измеряют в остановленном радиохимическом анализе путем включения глюкозы из UDP-[¹⁴C]глюкозы (в случае животных и грибковых ферментов) или ADP-[¹⁴C]глюкозы (в случае бактериальных ферментов) в гликоген ^4,5. Аналогичным образом, гликогенфосфорилазу измеряют в направлении синтеза гликогена после включения глюкозы из [¹⁴С]глюкозо-1-фосфата в гликоген⁶. Ветвящийся фермент анализируют путем измерения способности этого фермента стимулировать включение [¹⁴С]глюкозы из глюкозо-1-фосфата в α1,4-связанные цепи гликогенфосфорилазой⁷, а активность фермента деветривания определяют путем следования способности фермента включать [¹⁴С]глюкозу в гликоген⁸ . Будучи очень чувствительными, что позволяет использовать их в сырых клеточных экстрактах с низким уровнем активности ферментов, радиоактивные субстраты являются дорогостоящими и подчиняются нормативным требованиям, связанным с использованием радиоизотопов. Эти барьеры делают использование определенных анализов недоступным для многих работников. Однако в течение многих лет было описано впечатляющее разнообразие спектрофотометрических подходов к измерению этих ферментов. В целом, эти подходы в конечном итоге основаны на измерении производства или потребления NADH / NADPH или генерации цветных комплексов между гликогеном и йодом. Таким образом, они просты и могут быть выполнены с помощью простых спектрофотометров, оснащенных только вольфрамовыми или ксеноновыми лампами-вспышками.

Спектрофотометрические анализы гликогенсинтазы основаны на измерении нуклеозиндифосфата, высвобождаемого донором нуклеотида сахара, когда глюкоза добавляется к растущей гликогенной^{цепи 9,10}. Процедура измерения активности гликогенсинтазы, описанная в разделе 1 протокола ниже, является модификацией процедуры, описанной в Wayllace et ^al.11, и схема связи показана ниже:

(Глюкоза) _n + UPD-глюкоза → (глюкоза)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

АДФ + фосфоенолпируват → пируват + АТФ

Пируват + NADH + H⁺ → лактат + NAD⁺

Гликогенсинтаза добавляет глюкозу из UDP-глюкозы на гликоген. UDP, генерируемый в этом процессе, превращается в UTP нуклеозиндифосфаткиназой (NDP-киназой) в реакции, которая генерирует ADP. АДФ, в свою очередь, затем служит субстратом для пируваткиназы, которая фосфорилирует АДФ с использованием фосфоэнолпирувата в качестве донора фосфата. Полученный пируват превращается в лактат ферментом лактатдегидрогеназой в реакции, которая потребляет NADH. Таким образом, анализ может быть выполнен непрерывным образом, контролируя снижение поглощения при 340 нм по мере потребления NADH. Он легко адаптирован для использования с ферментами, которые требуют АДФ-глюкозы в качестве донора глюкозы. Здесь этапы связи проще, поскольку АДФ, высвобождаемый под действием гликогенсинтазы, непосредственно воздействует на пируваткиназу.

Существуют различные спектрофотометрические анализы, доступные для определения активности гликогенфосфорилазы. В классическом варианте фермент движется назад, в направлении синтеза гликогена, как показано ниже:

(Глюкоза) _n + Глюкозо-1-фосфат → (Глюкоза)_n+1 + P_i

Через определенные промежутки времени аликвоты реакционной смеси удаляются, а количество высвобождаемого фосфата количественно определяется^12,13. В наших руках этот анализ имеет ограниченное применение из-за наличия легко измеримого свободного фосфата во многих коммерческих препаратах глюкозо-1-фосфата в сочетании с высокими концентрациями глюкозо-1-фосфата, необходимыми для действия фосфорилазы. Скорее, мы обычно используем альтернативный анализ, который измеряет глюкозо-1-фосфат, высвобождаемый при разложении гликогена фосфорилазой¹³. Используется схема сопряженной реакции, проиллюстрированная ниже.

(Глюкоза) _n + P_i → (глюкоза)_n-1 + глюкозо-1-фосфат

Глюкозо-1-фосфат → глюкозо-6-фосфат

Глюкозо-6-фосфат + NADP⁺ → 6-фосфоглюконолактон + NADPH + H⁺

Глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат фосфоглюкомутазой, а глюкозо-6-фосфат затем окисляется до 6-фосфоглюконолактона с сопутствующим восстановлением NADP⁺ до NADPH. Процедура, описанная в разделе 2 протокола ниже, получена из методов, описанных Mendicino et ^al.14 и Schreiber & Bowling¹⁵. Анализ может быть легко выполнен непрерывным образом, с увеличением абсорбции на 340 нм с течением времени, что позволяет определить скорость реакции.

Спектрофотометрическое определение активности деветвирующего фермента основывается на измерении глюкозы, высвобождаемой действием фермента на предел фосфорилазы декстрина¹⁶. Это соединение производится путем исчерпывающей обработки гликогена гликогенфосфорилазой. Поскольку действие фосфорилазы гликогена останавливает 4 остатка глюкозы от точки α1,6-ветви, предел декстрина содержит гликоген, внешние цепи которого были укорочены до ~4 остатков глюкозы. Получение предельного декстрина фосфорилазы описано здесь с использованием процедуры, полученной из тех, которые были разработаны Taylor et ^al.17 и Makino & Omichi¹⁸.

Дебрафингирование представляет собой двухэтапный процесс. Активность 4-α-глюканотрансферазы бифункционального деветвирующего фермента сначала переносит три остатка глюкозы из точки ветви в неизлучающий конец близлежащей α1,4-связанной глюкозной цепи. Одиночный, α1,6-связанный остаток глюкозы, оставшийся в точке ветвления, затем гидролизуется активностью α1,6-глюкозидазы¹⁹. Анализ обычно выполняется остановленным образом, глюкоза, высвобождаемая через определенное время (или серию раз), измеряется в связанном ферментном анализе, как показано ниже:

(Глюкоза) _n → (глюкоза)_n-1 + глюкоза

Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ

Глюкозо-6-фосфат + NADP⁺ → 6-фосфоглюконолактон + NADPH + H⁺

Определение NADPH производится, дает меру производства глюкозы. Процедура, изложенная в разделе 3 протокола ниже, основана на процедуре, описанной Нельсоном и ^др.16. Как и другие методы, которые полагаются на потребление или генерацию NADH / NADPH, анализ довольно чувствителен. Однако наличие амилаз или других глюкозидаз, которые также могут высвобождать свободную глюкозу из фосфорилазы предельного декстрина, вызовет значительные помехи (см. Обсуждение).

Колориметрическое определение активности ветвящихся ферментов основывается на том, что α1,4-связанные цепи глюкозы принимают спиральные структуры, которые связываются с йодом, образуя цветные комплексы²⁰. Цвет образующегося комплекса зависит от длины α1,4-связанных цепей. Таким образом, амилоза, состоящая из длинных, в значительной степени неразветвленных цепочек α1,4-связанной глюкозы, образует темно-синий комплекс с йодом. Напротив, гликогены, внешние цепи которых, как правило, имеют длину от 6 до 8 остатков глюкозы, образуют оранжево-красные комплексы. Если раствор амилозы инкубируют с ветвящимся ферментом, введение ветвей в амилозу приводит к образованию более коротких α1,4-связанных цепей глюкозы. Таким образом, максимум поглощения комплексов амилоза/йод смещается в сторону более коротких длин волн. Процедура, обсуждаемая здесь, получена из того, что подробно описано в Boyer & Preiss²¹ , и активность ветвящегося фермента количественно определяется как снижение поглощения комплекса амилозы / йода при 660 нм с течением времени.

Как должно быть ясно из обсуждения выше, тот факт, что цвета комплексов, образующихся между цепями йода и α1,4-глюкозы, изменяются в зависимости от длины цепи, означает, что спектры поглощения комплексов гликоген/йод должны изменяться в зависимости от степени ветвления гликогена. Это действительно так, и менее разветвленные гликогены / гликогены с более длинными внешними цепями поглощают свет на более длинной длине волны, чем гликогены, которые более разветвлены / имеют более короткие внешние цепи. Таким образом, реакция окрашивания йодом может быть использована для получения быстрых качественных данных о степени ветвления гликогена²². Оранжево-коричневый цвет образуется, когда комплексы гликогена с йодом не отличаются особой интенсивностью. Однако развитие цвета может быть усилено включением насыщенного раствора хлорида кальция²². Это повышает чувствительность метода примерно в 10 раз и позволяет проводить готовый анализ микрограммовых количеств гликогена. Анализ для определения ветвления, описанный в разделе 4 протокола ниже, адаптирован из процедуры, разработанной Krisman²². Его проводят просто путем объединения образца гликогена с раствором йода и хлорида кальция в кювете и сбора спектра поглощения от 330 нм до 800 нм. Максимум поглощения смещается в сторону более длинных волн по мере уменьшения степени ветвления.

В совокупности методы, описанные здесь, обеспечивают простые, надежные средства оценки активности ключевых ферментов метаболизма гликогена и получения качественных данных о степени ветвления гликогена.

Protocol

1. Определение активности гликогенсинтазы Готовят исходные растворы необходимых реагентов, как указано в таблице 1 (до дня эксперимента). Компонент Маршруты 50 мМ Трис p…

Representative Results

Определение активности гликогенсинтазыНа рисунке 1 показаны репрезентативные результаты анализов гликогенсинтазы с использованием очищенных ферментов. На панели А после небольшого отставания наблюдалось линейное снижение поглощения при 340 нм с течением ?…

Discussion

В целом, ключевыми преимуществами всех представленных методов являются их низкая стоимость, легкость, скорость и отсутствие зависимости от специализированного оборудования. Основным недостатком, который они все разделяют, является чувствительность по сравнению с другими доступными …

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625