Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico

Summary

Técnicas para medir a atividade de enzimas-chave do metabolismo do glicogênio são apresentadas, usando um espectrofotômetro simples operando na faixa visível.

Abstract

O glicogênio é sintetizado como uma forma de armazenamento de glicose por uma ampla gama de organismos, variando de bactérias a animais. A molécula compreende cadeias lineares de resíduos de glicose ligados a α1,4 com ramos introduzidos através da adição de ligações α1,6. Compreender como a síntese e degradação do glicogênio são reguladas e como o glicogênio atinge sua estrutura ramificada característica requer o estudo das enzimas de armazenamento de glicogênio. No entanto, os métodos mais comumente usados para estudar essas atividades enzimáticas normalmente empregam reagentes ou técnicas que não estão disponíveis para todos os investigadores. Aqui, discutimos uma bateria de procedimentos que são tecnicamente simples, econômicos e, ainda assim, capazes de fornecer informações valiosas sobre o controle do armazenamento de glicogênio. As técnicas requerem acesso a um espectrofotômetro, operando na faixa de 330 a 800 nm, e são descritas assumindo que os usuários empregarão cuvetes plásticas descartáveis. No entanto, os procedimentos são facilmente escaláveis e podem ser modificados para uso em um leitor de microplacas, permitindo análises altamente paralelas.

Introduction

O glicogênio é amplamente distribuído na natureza, com o composto sendo encontrado em bactérias, muitos protistas, fungos e animais. Nos microrganismos, o glicogênio é importante para a sobrevivência celular quando os nutrientes são limitantes e, em organismos superiores, como mamíferos, a síntese e a degradação do glicogênio servem para tamponar os níveis de glicose no sangue ^1,2,3. O estudo do metabolismo do glicogênio é, portanto, de importância para campos tão diversos como a microbiologia e a fisiologia dos mamíferos. Compreender o metabolismo do glicogênio requer estudar as principais enzimas da síntese de glicogênio (glicogênio sintase e a enzima ramificada) e degradação do glicogênio (glicogênio fosforilase e enzima desramificadora). Os ensaios padrão-ouro de glicogênio sintase, fosforilase, atividades enzimáticas ramificadas e desramificantes empregam isótopos radioativos. Por exemplo, a glicogênio sintase é geralmente medida em um ensaio radioquímico interrompido seguindo a incorporação de glicose de UDP-[14 C]glicose (no caso de enzimas animais e fúngicas) ou ADP-[¹⁴C]glicose (no caso de enzimas bacterianas) no glicogênio ^4,5. Da mesma forma, a glicogênio fosforilase é medida na direção da síntese de glicogênio, após a incorporação de glicose de [¹⁴C]glicose-1-fosfato em glicogênio⁶. A enzima ramificada é ensaiada medindo a capacidade desta enzima de estimular a incorporação de [14 C]glicose da glicose-1-fosfato em cadeias ligadas a α1,4 pela glicogênio fosforilase⁷, e a atividade enzimática de desramificação é determinada seguindo a capacidade da enzima de incorporar [¹⁴C]glicose no glicogênio⁸ . Embora muito sensíveis, permitindo seu uso em extratos de células brutas com baixos níveis de atividade enzimática, os substratos radioativos são caros e sujeitos aos requisitos regulatórios inerentes ao uso de radioisótopos. Essas barreiras colocam o uso de certos ensaios fora do alcance de muitos trabalhadores. No entanto, ao longo de muitos anos, uma impressionante variedade de abordagens espectrofotométricas para a medição dessas enzimas foram descritas. Em geral, essas abordagens dependem da medição da produção ou consumo de NADH / NADPH, ou a geração de complexos coloridos entre glicogênio e iodo. Assim, eles são simples e podem ser realizados usando espectrofotômetros simples equipados apenas com lâmpadas de tungstênio ou xenônio.

Os ensaios espectrofotométricos da glicogênio sintase dependem da medição do difosfato nucleosídeo liberado do doador de nucleotídeos de açúcar à medida que a glicose é adicionada à crescente cadeia de glicogênio ^9,10. O procedimento para medir a atividade da glicogênio sintase descrito na seção 1 do protocolo, abaixo, é uma modificação do delineado por Wayllace et ^al.11, e o esquema de acoplamento é mostrado abaixo:

(Glicose) _n + UPD-glicose → (Glicose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H + Lactato de → + NAD ⁺

A glicogênio sintase adiciona glicose da UDP-glicose ao glicogênio. O UDP gerado neste processo é convertido em UTP pelo nucleosídeo difosfato quinase (NDP quinase), em uma reação que gera ADP. O ADP, por sua vez, serve então como substrato para a piruvato quinase, que fosforila o ADP usando fosfoenolpiruvato como doador de fosfato. O piruvato resultante é convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase em uma reação que consome NADH. O ensaio pode, portanto, ser realizado de forma contínua, monitorando a diminuição da absorvância a 340 nm à medida que o NADH é consumido. É prontamente adaptado para uso com enzimas que requerem ADP-glicose como um doador de glicose. Aqui, as etapas de acoplamento são mais simples, uma vez que o ADP liberado pela ação da glicogênio sintase é diretamente atuado pela piruvato quinase.

Há uma variedade de ensaios espectrofotométricos disponíveis para a determinação da atividade da glicogênio fosforilase. Na versão clássica, a enzima é conduzida para trás, na direção da síntese de glicogênio, como mostrado abaixo:

(Glicose) _n + Glicose-1-fosfato → (Glicose)_n+1 + P_i

Em intervalos cronometrados, as alíquotas da mistura reacional são removidas e a quantidade de fosfato liberado é quantificada^12,13. Em nossas mãos, este ensaio tem sido de uso limitado devido à presença de fosfato livre prontamente mensurável em muitas preparações comerciais de glicose-1-fosfato, combinado com as altas concentrações de glicose-1-fosfato necessárias para a ação da fosforilase. Em vez disso, temos empregado rotineiramente um ensaio alternativo que mede a glicose-1-fosfato liberado à medida que o glicogênio é degradado pela fosforilase¹³. Um esquema de reação acoplado, ilustrado abaixo, é empregado.

(Glicose) n + P_i → (Glicose)_n-1 + Glicose-1-fosfato

Glicose-1-fosfato → Glicose-6-fosfato

Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

A glicose-1-fosfato é convertida em glicose-6-fosfato pela fosfoglucomutase, e a glicose-6-fosfato é então oxidada em 6-fosfogluconolactona, com a concomitante redução de NADP⁺ para NADPH. O procedimento detalhado na seção 2 do protocolo, a seguir, é derivado dos métodos descritos por Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling ¹⁵. O ensaio pode ser prontamente realizado de forma contínua, com o aumento da absorbância a 340 nm ao longo do tempo, permitindo a determinação da taxa de reação.

A determinação espectrofotométrica da atividade enzimática desramificadora baseia-se na mensuração da glicose liberada pela ação da enzima sobre a dextrina limite de fosforilase¹⁶. Este composto é feito através do tratamento exaustivo do glicogênio com glicogênio fosforilase. Uma vez que a ação da glicogênio fosforilase pára 4 resíduos de glicose de distância de um ponto de ramificação α1,6, a dextrina limite contém glicogênio, cujas cadeias externas foram encurtadas para ~ 4 resíduos de glicose. O preparo da dextrina limite de fosforilase é descrito aqui, utilizando-se um procedimento derivado daqueles desenvolvidos por Taylor et al.17 e Makino & Omichi ¹⁸.

A desramificação é um processo de duas etapas. A atividade da 4-α-glucanotransferase da enzima desramificadora bifuncional primeiro transfere três resíduos de glicose do ponto de ramificação para a extremidade não redutora de uma cadeia de glicose ligada a α1,4 próxima. O único resíduo de glicose ligado a α1,6 remanescente no ponto de ramificação é então hidrolisado pela atividade da α1,6-glucosidase¹⁹. O ensaio é tipicamente realizado de forma interrompida, a glicose liberada após um determinado tempo (ou série de vezes) sendo medida em um ensaio enzimático acoplado, conforme mostrado abaixo:

(Glicose) n → (Glicose)_n-1 + Glicose

Glicose + ATP → Glicose-6-fosfato + ADP

Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

A determinação do NADPH produzido fornece uma medida da produção de glicose. O procedimento descrito na seção 3 do protocolo, a seguir, baseia-se em um descrito por Nelson et ^al.16. Como os outros métodos que dependem do consumo ou geração de NADH / NADPH, o ensaio é bastante sensível. No entanto, a presença de amilases ou outras glucosidases, que também podem liberar glicose livre da dextrina limite de fosforilase, causará interferência significativa (ver Discussão).

A determinação colorimétrica da atividade enzimática ramificada baseia-se no fato de que cadeias de glicose ligadas a α1,4 adotam estruturas helicoidais que se ligam ao iodo, formando complexos coloridos²⁰. A cor do complexo formado depende do comprimento das cadeias ligadas a α1,4. Assim, a amilose, que consiste em cadeias longas, em grande parte não ramificadas, de glicose ligada a α1,4, forma um complexo azul profundo com iodo. Em contraste, os glicogênios, cujas cadeias externas são geralmente da ordem de apenas 6 a 8 resíduos de glicose de comprimento, formam complexos vermelho-alaranjados. Se uma solução de amilose é incubada com enzima ramificada, a introdução de ramos na amilose resulta na geração de cadeias de glicose mais curtas ligadas a α1,4. Assim, o máximo de absorção dos complexos amilose/iodo muda para comprimentos de onda mais curtos. O procedimento discutido aqui é derivado do detalhado por Boyer & Preiss²¹ e a atividade enzimática ramificada é quantificada como uma redução na absorção do complexo amilose/iodo a 660 nm ao longo do tempo.

Como deve ser facilmente aparente a partir da discussão acima, o fato de que as cores dos complexos formados entre as cadeias de iodo e α1,4-glicose variam com o comprimento da cadeia significa que os espectros de absorvância dos complexos glicogênio/iodo devem variar com o grau de ramificação do glicogênio. Este é de fato o caso, e glicogênios / glicogênios menos ramificados com cadeias externas mais longas absorvem a luz em um comprimento de onda mais longo do que os glicogênios que são mais ramificados / têm cadeias externas mais curtas. A reação de coloração de iodo pode, portanto, ser usada para obter dados qualitativos rápidos sobre o grau de ramificação do glicogênio²². A cor laranja-marrom se forma quando os complexos de glicogênio com iodo não são particularmente intensos. No entanto, o desenvolvimento da cor pode ser potencializado pela inclusão de solução saturada de cloreto de cálcio²². Isso aumenta a sensibilidade do método cerca de 10 vezes e permite a análise pronta das quantidades de microgramas de glicogênio. O ensaio para a determinação da ramificação descrito na seção 4 do protocolo, a seguir, é adaptado de um procedimento desenvolvido por Krisman²². É realizado simplesmente combinando a amostra de glicogênio com solução de iodo e cloreto de cálcio em uma cubeta e coletando o espectro de absorção de 330 nm a 800 nm. A absorbância máxima muda para comprimentos de onda mais longos à medida que o grau de ramificação diminui.

Coletivamente, os métodos aqui descritos fornecem meios simples e confiáveis de avaliar as atividades das principais enzimas do metabolismo do glicogênio e de obter dados qualitativos sobre a extensão da ramificação do glicogênio.

Protocol

1. Determinação da atividade da glicogênio sintase Preparar soluções-mãe dos reagentes necessários, conforme indicado no quadro 1 (antes do dia experimental). Componente Trajeto 50 mM Tris pH 8,0 Dissolva 0,61 g de base Tris em ~ 80 mL de água.  Arrefecer a 4 °C.   Ajust…

Representative Results

Determinação da atividade da glicogênio sintaseA Figura 1 mostra resultados representativos de ensaios de glicogênio sintase utilizando enzimas purificadas. No painel A, após um ligeiro atraso, houve uma diminuição linear na absorção a 340 nm ao longo do tempo por um período de cerca de 12 min. A taxa de mudança na absorção na Figura 1A foi de ~0,12 unidades de absorbância/min. Uma taxa de mudança na absorbância entre ~0,010 …

Discussion

Em geral, as principais vantagens de todos os métodos apresentados são seu baixo custo, facilidade, velocidade e falta de dependência de equipamentos especializados. A principal desvantagem que todos eles compartilham é a sensibilidade em comparação com outros métodos disponíveis. A sensibilidade dos procedimentos que envolvem a produção ou o consumo de NADH/NADPH é fácil de estimar. Dado que o coeficiente de extinção do NADH/NADPH é de 6,22 M-1 cm-1, a aritmética simples indica que ~^10-20 μM …

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625