Spektrofotometriske metoder til undersøgelse af eukaryot glykogenmetabolisme

Summary

Teknikker til måling af aktiviteten af nøgleenzymer af glykogenmetabolisme præsenteres ved hjælp af et simpelt spektrofotometer, der opererer i det synlige område.

Abstract

Glykogen syntetiseres som en opbevaringsform af glukose af en bred vifte af organismer, lige fra bakterier til dyr. Molekylet består af lineære kæder af α1,4-bundne glucoserester med grene introduceret ved tilsætning af α1,6-bindinger. At forstå, hvordan syntesen og nedbrydningen af glykogen reguleres, og hvordan glykogen opnår sin karakteristiske forgrenede struktur, kræver undersøgelse af enzymerne til glykogenlagring. Imidlertid anvender de metoder, der oftest anvendes til at studere disse enzymaktiviteter, typisk reagenser eller teknikker, der ikke er tilgængelige for alle efterforskere. Her diskuterer vi et batteri af procedurer, der er teknisk enkle, omkostningseffektive og alligevel i stand til at give værdifuld indsigt i kontrollen med glykogenlagring. Teknikkerne kræver adgang til et spektrofotometer, der opererer i området 330 til 800 nm, og er beskrevet under forudsætning af, at brugerne vil anvende engangskuvetter af plast. Procedurerne er dog let skalerbare og kan ændres til brug i en mikropladelæser, hvilket muliggør meget parallel analyse.

Introduction

Glykogen er bredt fordelt i naturen, hvor forbindelsen findes i bakterier, mange protister, svampe og dyr. I mikroorganismer er glykogen vigtig for celleoverlevelse, når næringsstoffer er begrænsende, og i højere organismer som pattedyr tjener syntese og nedbrydning af glykogen til at buffer blodglukoseniveauer ^1,2,3. Undersøgelsen af glykogenmetabolisme er derfor af betydning for så forskellige områder som mikrobiologi og pattedyrfysiologi. Forståelse af glykogenmetabolisme kræver undersøgelse af nøgleenzymerne i glykogensyntese (glykogensyntase og forgreningsenzymet) og glykogennedbrydning (glykogenphosphorylase og forgrenet enzym). Guldstandardanalyserne af glykogensyntase, phosphorylase, forgrening og afgrening af enzymaktiviteter anvender radioaktive isotoper. For eksempel måles glykogensyntase generelt i et stoppet radiokemisk assay ved at følge inkorporeringen af glucose fra UDP-[14 C] glucose (i tilfælde af dyre- og svampeenzymer) eller ADP-[¹⁴C] glucose (i tilfælde af bakterielle enzymer) i glykogen ^4,5. Tilsvarende måles glykogenphosphorylase i retning af glykogensyntese efter inkorporering af glucose fra [¹⁴C] glucose-1-phosphat i glykogen⁶. Forgreningsenzymet analyseres ved at måle dette enzyms evne til at stimulere inkorporeringen af [14 C] glucose fra glucose-1-phosphat i α1,4-bundne kæder ved glykogenphosphorylase⁷, og afgrenende enzymaktivitet bestemmes ved at følge enzymets evne til at inkorporere [¹⁴C] glucose i glykogen⁸ . Selvom de er meget følsomme, tillader de deres anvendelse i rå celleekstrakter med lave niveauer af enzymaktivitet, er de radioaktive substrater dyre og underlagt de lovgivningsmæssige krav, der følger med radioisotopbrug. Disse barrierer placerer brugen af visse analyser uden for mange arbejdstageres rækkevidde. I løbet af mange år er der imidlertid beskrevet en imponerende række spektrofotometriske tilgange til måling af disse enzymer. Generelt er disse tilgange i sidste ende afhængige af at måle produktionen eller forbruget af NADH / NADPH eller genereringen af farvede komplekser mellem glykogen og jod. Således er de ligetil og kan udføres ved hjælp af enkle spektrofotometre udstyret med kun wolfram- eller xenon-blitzlamper.

Spektrofotometriske assays af glykogensyntase er afhængige af måling af nukleosiddiphosphat frigivet fra sukkernukleotiddonoren, da glucose tilsættes til den voksende glykogenkæde ^9,10. Fremgangsmåden til måling af glykogensyntaseaktivitet, der er beskrevet i afsnit 1 i protokollen nedenfor, er en ændring af den, der er skitseret af Wayllace et ^al.11, og koblingsskemaet er vist nedenfor:

(Glukose) _n + UPD-glucose → (glucose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + phosphoenolpyruvat → pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H + → laktat + NAD ⁺

Glykogensyntase tilføjer glukose fra UDP-glucose til glykogen. UDP genereret i denne proces omdannes til UTP af nukleosiddiphosphatkinase (NDP-kinase) i en reaktion, der genererer ADP. ADP tjener igen som et substrat for pyruvatkinase, som phosphorylerer ADP ved anvendelse af phosphoenolpyruvat som fosfatdonor. Det resulterende pyruvat omdannes til lactat af enzymet lactat dehydrogenase i en reaktion, der forbruger NADH. Analysen kan derfor udføres kontinuerligt og overvåge faldet i absorbans ved 340 nm, når NADH forbruges. Det er let tilpasset til brug med enzymer, der kræver ADP-glucose som glukosedonor. Her er koblingstrinnene enklere, da ADP frigivet ved virkningen af glykogensyntase påvirkes direkte af pyruvatkinase.

Der er en række spektrofotometriske assays til rådighed til bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet. I den klassiske version drives enzymet baglæns i retning af glykogensyntese som vist nedenfor:

(Glukose) _n + Glucose-1-phosphat → (glucose)_n+1 + P_i

Med tidsbestemte intervaller fjernes alikvoter af reaktionsblandingen, og mængden af frigjort fosfat kvantificeres^12,13. I vores hænder har dette assay været af begrænset anvendelse på grund af tilstedeværelsen af let målbart frit fosfat i mange kommercielle præparater af glucose-1-phosphat kombineret med de høje koncentrationer af glucose-1-phosphat, der kræves til phosphorylasevirkning. I stedet har vi rutinemæssigt anvendt et alternativt assay, der måler glukose-1-fosfat, der frigives som glykogen, nedbrydes af phosphorylase¹³. Der anvendes et koblet reaktionsskema, der er illustreret nedenfor.

(Glukose) n + P_i → (glucose)_n-1 + _{glucose-1-phosphat}

Glucose-1-phosphat → glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat + NADP + → 6-phosphogluconolacton + NADPH + H ⁺

Glucose-1-phosphatet omdannes til glucose-6-phosphat ved phosphoglucomutase, og glucose-6-phosphatet oxideres derefter til 6-phosphogluconolacton med samtidig reduktion af NADP ⁺ til NADPH. Proceduren, der er beskrevet i afsnit 2 i protokollen nedenfor, er afledt af metoder beskrevet af Mendicino et al.14 og Schreiber & Bowling ¹⁵. Analysen kan let udføres kontinuerligt med stigningen i absorbans ved 340 nm over tid, hvilket muliggør bestemmelse af reaktionshastigheden.

Spektrofotometrisk bestemmelse af forgrenet enzymaktivitet er afhængig af måling af glukosen frigivet ved enzymets virkning på phosphorylase limit dextrin¹⁶. Denne forbindelse fremstilles ved at behandle glykogen udtømmende med glykogenphosphorylase. Da glykogenphosphorylasevirkning stopper 4 glucoserester væk fra et α1,6-grenpunkt, indeholder grænsedextrin glykogen, hvis ydre kæder er blevet forkortet til ~ 4 glukoserester. Fremstilling af phosphorylase limit dextrin er beskrevet her ved hjælp af en procedure afledt af dem, der er udviklet af Taylor et al.17 og Makino & Omichi¹⁸.

Afgrening er en to-trins proces. 4-α-glucanotransferaseaktiviteten af det bifunktionelle afgreningsenzym overfører først tre glucoserester fra grenpunktet til den ikke-reducerende ende af en nærliggende α1,4-bundet glukosekæde. Den enkelte α1,6-bundne glucoserest, der er tilbage ved grenpunktet, hydrolyseres derefter af α1,6-glucosidaseaktiviteten¹⁹. Analysen udføres typisk på en stoppet måde, idet glukosen, der frigives efter en given tid (eller række gange), måles i et koblet enzymassay som vist nedenfor:

(Glukose) n → (glukose)_n-1 + glukose

Glucose + ATP → glucose-6-phosphat + ADP

Glucose-6-phosphat + NADP + → 6-phosphogluconolacton + NADPH + H ⁺

Bestemmelsen af produceret NADPH giver et mål for glukoseproduktion. Den procedure, der er beskrevet i afsnit 3 i protokollen nedenfor, er baseret på en beskrevet af Nelson et ^al.16. Ligesom de andre metoder, der er afhængige af forbruget eller genereringen af NADH / NADPH, er analysen ret følsom. Tilstedeværelsen af amylaser eller andre glucosidaser, som også kan frigøre fri glucose fra phosphorylasegrænsedextrin, vil imidlertid forårsage betydelig interferens (se Diskussion).

Den kolorimetriske bestemmelse af forgrenet enzymaktivitet er afhængig af det faktum, at α1,4-bundne glukosekæder vedtager spiralformede strukturer, der binder til jod og danner farvede komplekser²⁰. Farven på det dannede kompleks afhænger af længden af α1,4-bundne kæder. Således danner amylose, som består af lange, stort set uforgrenede kæder af α1,4-bundet glucose, et dybblåt kompleks med jod. I modsætning hertil danner glykogener, hvis ydre kæder generelt er i størrelsesordenen kun 6 til 8 glucoserester lange, orange-røde komplekser. Hvis en opløsning af amylose inkuberes med forgreningsenzym, resulterer indførelsen af grene i amylose i dannelsen af kortere α1,4-bundne glucosekæder. Således skifter absorptionsmaksimum for amylose / jodkomplekserne mod kortere bølgelængder. Den procedure, der diskuteres her, er afledt af den, der er beskrevet af Boyer & Preiss²¹ , og forgreningsenzymaktivitet kvantificeres som en reduktion i absorptionen af amylose / jodkomplekset ved 660 nm over tid.

Som det burde være let at se af diskussionen ovenfor, betyder det faktum, at farverne på de komplekser, der dannes mellem jod- og α1,4-glukosekæder, varierer med kædelængden, at absorbansspektrene for glykogen/jodkomplekser bør variere med graden af glykogenforgrening. Dette er faktisk tilfældet, og mindre forgrenede glykogener / glykogener med længere ydre kæder absorberer lys ved en længere bølgelængde end glykogener, der er mere forgrenede / har kortere ydre kæder. Jodfarvningsreaktionen kan derfor bruges til at opnå hurtige, kvalitative data om graden af glykogenforgrening²². Den orangebrune farve dannes, når glykogenkomplekser med jod ikke er særlig intens. Farveudviklingen kan dog forbedres ved inkludering af mættet calciumchloridopløsning²². Dette øger metodens følsomhed ca. 10 gange og muliggør klar analyse af mikrogrammængder af glykogen. Analysen til bestemmelse af forgrening, der er beskrevet i afsnit 4 i protokollen nedenfor, er tilpasset fra en procedure udviklet af Krisman²². Det udføres simpelthen ved at kombinere glykogenprøven med jodopløsning og calciumchlorid i en kuvette og opsamle absorptionsspektret fra 330 nm til 800 nm. Absorbansmaksimumet skifter mod længere bølgelængder, når forgreningsgraden falder.

Samlet set giver de metoder, der er beskrevet her, enkle, pålidelige midler til at vurdere aktiviteterne i de vigtigste enzymer i glykogenmetabolisme og til opnåelse af kvalitative data om omfanget af glykogenforgrening.

Protocol

1. Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet Der fremstilles stamopløsninger af krævede reagenser som angivet i tabel 1 (før forsøgsdagen). Komponent Rutevejledning 50 mM Tris pH 8,0 Opløs 0,61 g Tris base i ~ 80 ml vand.  Chill til 4 °C.   Juster pH til 8,0 med HCI og gør v…

Representative Results

Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitetFigur 1 viser repræsentative resultater fra glykogensyntaseassays ved anvendelse af oprensede enzymer. I panel A var der efter en lille forsinkelse et lineært fald i absorptionen ved 340 nm over tid i en periode på ca. 12 min. Ændringshastigheden i absorptionen i figur 1A var ~0,12 absorbansenheder/min. En ændringshastighed i absorbans mellem ~0,010 og ~0,20 absorbansenheder/min er optimal, og mæn…

Discussion

Generelt er de vigtigste fordele ved alle de præsenterede metoder deres lave omkostninger, lethed, hastighed og manglende afhængighed af specialudstyr. Den største ulempe, som de alle deler, er følsomhed sammenlignet med andre tilgængelige metoder. Følsomheden af de procedurer, der involverer produktion eller forbrug af NADH/NADPH, er let at estimere. I betragtning af at udryddelseskoefficienten for NADH / NADPH er 6,22 M-1 cm-1, indikerer simpel aritmetik, at ~ ^10-20 μM ændringer i koncentration let k…

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625