Screening av tobaksgenotyper för Phytophthora nicotianae Resistance
Summary
Här presenteras ett protokoll för effektiv och korrekt screening av tobaksgenotyper för Phytophthora nicotianae motstånd i plantor. Detta är ett praktiskt tillvägagångssätt för precisionsuppfödning, liksom molekylär mekanismforskning.
Abstract
Svart skaft, orsakad av oomycetes Phytophthora nicotianae, är destruktiv för tobak, och denna patogen är högpatogen för många solanaceous grödor. P. nicotianae är väl anpassad till höga temperaturer; Därför blir forskningen om denna patogen allt viktigare inom jordbruket över hela världen på grund av den globala uppvärmningen. P. nicotianae-resistenta sorter av tobaksplantor screenas ofta genom inokulering med havrekorn koloniserade av P. nicotianae och övervakning för sjukdomssymptomen. Det är dock svårt att kvantifiera inokuleringsintensiteten eftersom korrekt inokulering är avgörande i detta fall. Denna studie syftade till att utveckla en effektiv och tillförlitlig metod för att utvärdera tobakens motståndskraft mot infektion med P. nicotianae. Denna metod har framgångsrikt använts för att identifiera resistenta sorter, och inokuleringseffektiviteten bekräftades av PCR i realtid. Den resistensutvärderingsmetod som presenteras i denna studie är effektiv och praktisk för precisionsuppfödning, samt molekylär mekanismforskning.
Introduction
P. nicotianae är destruktiv för många solanaceous grödor. Det kan orsaka tobak “svart skaft”1, potatisfoliering och knölrot2, tomat- och paprikakrona och rotrot3 och Goji krage och rotrot4. P. nicotianae kan attackera alla delar av tobaksplantor, inklusive rötter, stjälkar och löv i alla odlingsstadier5. Det vanligaste symptomet på sjukdomen är stjälkens svarta bas. Rötterna är initialt synliga som vattendränkta och blir sedan nekrotiska, och bladen visar stora cirkulära lesioner5. Denna sjukdom kan vara förödande för en tobaksväxt i växthuset, liksom i fältet6. Den mest praktiska och ekonomiska metoden för att kontrollera P. nicotianae är användningen av resistenta sorter7. Det krävs dock ett effektivt screeningprotokoll för identifiering av P. nicotianae-resistenta anslutningar från tobaksgroddsplasma samlingar.
Olika identifieringsmetoder har beskrivits för att bedöma P. nicotianaresistens hos tobak7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. I allmänhet har tre huvudsakliga metoder använts för identifiering av P. nicotianae-resistenta tobaks genotyper. Den första inkluderar blandning av mycelia med agarmedium på Petri-plattor som innehåller P. nicotianae. Mycelia odlas sedan i mörkret vid rumstemperatur i 2 veckor. 1 L avjoniserat vatten tillsätts mycelia och homogeniseras i 30 s. Inokulat hålls på is tills det behövs. Två hål (1 cm i diameter och 4-5 cm djupa) görs på varje sida av växten, och 10 ml inokulat hälls i varje hål. Hålen fylls sedan med den omgivande jorden och sjukdomsutvecklingen övervakas dagligen i 2 veckor8,10.
I den andra metoden inokuleras växterna med patogeninfekterade tandpetare. För detta tillvägagångssätt bör växterna användas cirka 6 veckor efter transplantation och bör ha en minimihöjd på 30 cm. Autoklaverade tandpetare placeras på ytan av kulturer som innehåller P. nicotianae mycelia. Odlingsfaten förvaras sedan under ljuset i rumstemperatur i 7 dagar. Sedan används koloniserade tandpetare för att inokulera växterna. Tandpetare sätts in i tobaksstammarna mellan den fjärde och femte noderna. Växterna övervakas dagligen i 5 dagar9,15. Denna metod är inte tillämplig för små plantor. Eftersom inokulat är patogeninfekterade tandpetare kan inokuleringsintensiteten inte kontrolleras exakt.
Det vanligaste tillvägagångssättet involverar havrekorn för inokulering. I detta fall bereds havrekorn genom autoklavering 500 ml havre och 300 ml avjoniserat vatten vid 121 °C i 1 timme en gång per dag i 3 dagar. Sedan läggs havrekorn till det patogenkoloniserade odlingsmediet. Rätterna förseglas med paraffinfilm och inkuberas vid 25 °C i ljus i 7-12 dagar. Fyra separata 5 cm djupa hål görs på pottingjorden, 4 cm från varje växt, och en patogeninfekterad havrekorn placeras i varje hål. Inkubationstiden bestäms baserat på när det första symptomet ovan jord inträffar7,11,12,13,14,15,16. Denna metod är effektiv och tillämplig för storskalig resistensscreening. En begränsning av detta tillvägagångssätt är dock att inokulat är patogeninfekterade havrekorn, därför kan inokuleringsintensiteten inte kontrolleras exakt.
Presenteras här är dock en mer exakt metod som är tillämplig på tillväxtkammare motstånd utvärdering. Jämfört med de andra metoderna är inokulat zoospore suspension, därför är inokuleringsintensiteten kontrollerbar och justerbar. Eftersom tobaksplantorna i denna studie odlas utan jord är resultaten lättare att observera. Dessutom orsakar provtagning av växtrötter från jorden alltid skador på rötterna, vilket inducerar en serie fysiologiska svar17. I denna metod, eftersom växter odlas utan jord, kan störningen i rotskador elimineras. Sammanfattningsvis är denna metod mer praktisk för molekylär mekanismforskning och precisionsuppfödning. Med hjälp av det här protokollet erhålls data vanligtvis inom 5 dagar, med mer än 200 växter utvärderade i ett enda experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera resistenskällor har använts för att förbättra P. nicotianae resistensen i odlad tobak. Endominerande R gener, Php och Phl, har introgressed från Nicotiana plumbaginifolia respektive Nicotiana longiflora, respektive10. Cigarrtobakssorten Beinhart 1000 har den högsta rapporterade nivån av kvantitativ resistens mot P. nicotianae13. Flera intervall mappning experiment har föreslagit att minst sex kvantitativa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31571738) och Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco ‘Beinhart 1000’ × ‘Hicks’ mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. . GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
