Summary
Questo studio presenta un protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive applicato ad una linea cellulare di glioma diffuso pediatrico della linea mediana, utile per studiare in tempo reale l'espressione delle proteine sulla membrana plasmatica durante processi dinamici come l'invasione e la migrazione delle cellule 3D.
Abstract
La migrazione e l'invasione cellulare sono caratteristiche specifiche dei tumori mutanti H3K27M del glioma diffuso della linea mediana (DMG). Abbiamo già modellato queste caratteristiche utilizzando saggi di invasione e migrazione tridimensionali (3D) basati su cellule. In questo studio, abbiamo ottimizzato questi saggi 3D per l'immunocitochimica delle cellule vive. Un antibody labeling reagent è stato utilizzato per rilevare in tempo reale l'espressione della molecola di adesione CD44, sulla membrana plasmatica delle cellule migranti e invasive di una linea cellulare primaria DMG H3K27M derivata dal paziente. CD44 è associato al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali ed è coinvolto nelle interazioni dirette con la matrice extracellulare del sistema nervoso centrale (SNC). Le neurosfere (NS) della linea cellulare DMG H3K27M sono state incorporate nella matrice della membrana basale (BMM) o posizionate su un sottile strato di rivestimento di BMM, in presenza di un anticorpo anti-CD44 in combinazione con il reagente di etichettatura degli anticorpi (ALR). L'analisi dell'immagine immunocitochimica delle cellule 3D vive è stata eseguita su uno strumento di analisi delle cellule vive per misurare quantitativamente l'espressione complessiva di CD44, in particolare sulle cellule migratorie e invasori. Il metodo consente inoltre di visualizzare in tempo reale l'espressione intermittente di CD44 sulla membrana plasmatica delle cellule migratorie e invasori. Inoltre, il test ha anche fornito nuove informazioni sul potenziale ruolo di CD44 nella transizione da mesenchimale ad ameboide nelle cellule DMG H3K27M.
Introduction
La capacità delle cellule tumorali di eludere e diffondersi attraverso il tessuto circostante è un segno distintivo del cancro1. In particolare, la motilità delle cellule tumorali è una caratteristica dei tumori maligni, sia che si tratti di un tipo di tumore metastatico come il cancro della mammella2 o del colon-retto3 o di un tipo localmente invasivo come il glioma diffuso 4,5.
L'imaging ha un ruolo centrale nello studio di molti aspetti dei fenotipi delle cellule tumorali; Tuttavia, l'imaging delle cellule vive è sicuramente da preferire quando si studiano processi cellulari dinamici come la migrazione e l'invasione, quando si verificano cambiamenti nella morfologia e nell'interazione cellula-cellula 6,7 e possono essere esaminati più facilmente nel tempo. Per l'imaging di cellule vive possono essere utilizzati diversi sistemi di microscopia ottica, dal contrasto di fase ai microscopi fluorescenti confocali, e l'acquisizione di immagini eseguita per un breve o lungo periodo di tempo su un microscopio invertito dotato di una camera per il controllo della temperatura e della CO2, o in sistemi di analisi delle immagini ad alto contenuto che hanno camere incorporate, o in alternativa in sistemi di immagini che possono stare nell'incubatore senza la necessità di disturbare le cellule durante l'intera durata dell'esperimento. La scelta del sistema utilizzato è spesso dettata da una serie di fattori quali la risoluzione necessaria, la durata del tempo e degli intervalli di tempo complessivi di acquisizione, il tipo di vaso utilizzato e la produttività del saggio (monocamera o piastra multipozzetto), la sensibilità delle cellule utilizzate (cellule preziose e/o rare) e la fototossicità delle cellule se sono presenti fluorofori.
Per quanto riguarda l'imaging fluorescente in modalità live, ciò può essere ottenuto trasducendo le cellule per l'espressione di proteine fluorescenti sia per l'espressione stabile che come sistema inducibile8, mediante trasfezione di cellule transitorie, o utilizzando coloranti cellulari che sono ora disponibili per l'etichettatura di cellule vive7, per il tracciamento di cellule vive e per l'etichettatura di organelli subcellulari9.
Un approccio utile è stato recentemente sviluppato per l'immunocitochimica delle cellule vive, in cui un anticorpo che riconosce un marcatore di superficie di scelta può essere legato a un reagente di marcatura e, dopo l'aggiunta ai terreni di coltura, le cellule che esprimono il marcatore specifico possono essere prontamente visualizzate in tempo reale mediante imaging di cellule vive. La visualizzazione e la quantificazione dell'espressione dei marcatori utilizzando un tale sistema possono essere facilmente ottenute quando le cellule sono coltivate in condizioni di coltura bidimensionale (2D)10.
In questo studio, abbiamo ottimizzato i protocolli per l'invasione immunocitochimica delle cellule immunocitochimiche 3D vive e la migrazione delle cellule derivate dai pazienti con glioma diffuso della linea mediana pediatrica (DMG)11,12. I DMG sono tumori cerebrali altamente aggressivi che colpiscono i bambini, per la stragrande maggioranza associati alla mutazione driver K27M nelle varianti H3 dell'istone. I DMG insorgono nel tronco encefalico e nelle regioni mediane del sistema nervoso centrale (SNC) e sono caratterizzati da una natura altamente infiltrativa. Questa capacità invasiva ha dimostrato di essere almeno in parte mediata dall'eterogeneità intratumorale e dalle caratteristiche simili a staminali tumorali delle cellule DMG7.
Per esemplificare i nostri test, è stato utilizzato un reagente di etichettatura anticorpale (ALR) in combinazione con un anticorpo per CD44. CD44 è una glicoproteina transmembrana e una molecola di adesione espressa sulle cellule staminali e su altri tipi di cellule, associata al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali13. I protocolli includono la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini in modalità brightfield e fluorescente e l'analisi su uno strumento di analisi di cellule vive che ha permesso di misurare quantitativamente in tempo reale l'espressione complessiva di CD44 sulla membrana cellulare DMG durante l'invasione e la migrazione 3D. I saggi hanno anche permesso di visualizzare il segnale fluorescente intermittente di CD44 su singole cellule durante la migrazione e l'invasione. È interessante notare che è stato osservato anche un effetto dell'anticorpo anti-CD44, che potenzialmente agendo come anticorpo bloccante, sembrava anche ridurre la migrazione e l'invasione cellulare, nonché indurre un passaggio del modello di invasione da un fenotipo mesenchimale collettivo a un fenotipo più simile all'ameboide a singola cellula.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici per la ricerca umana delle istituzioni.
NOTA: Questo studio è stato eseguito utilizzando Incucyte S3 e/o SX5 Live-Cell Analysis Instrument (indicato come strumento di analisi delle cellule vive).
1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni riproducibili
NOTA: Il protocollo (sezione 1) descritto da Vinci et al. 2015 7,12, è stato utilizzato come riportato di seguito, con alcune modifiche:
- Raccogliere le neurosfere (NS) mutanti DMG H3K27M e centrifugare a 170 x g per 10 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).
- Incubare il NS con 500 μL della soluzione di accutasi per 3 minuti a 37 °C per romperli.
- Neutralizzare la soluzione di accutasi con cellule staminali tumorali (TSM) mezzo7 e centrifugare la sospensione cellulare a 355 x g per 5 minuti a RT.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno TSM e quindi contare le cellule utilizzando una camera di conteggio delle cellule.
- Diluire la sospensione cellulare per ottenere 2,5-5 x 103cellule/ml e seminare 100 μL/pozzetto in piastre a fondo tondo a 96 pozzetti (ULA) ultra-low attachment (ULA) (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare una densità cellulare adeguata per ottenere NS individuali di ~ 300 μm di diametro, 4 giorni dopo la semina cellulare (250-500 cellule / pozzetto per cellule di glioma altamente aggressive).
- Confermare visivamente la formazione di NS utilizzando un microscopio invertito 4 giorni dopo la semina cellulare.
2. Preparazione del complesso ALR/anticorpo e messa a punto per il test di invasione
NOTA: Per la procedura di etichettatura degli anticorpi, viene utilizzato il protocollo di etichettatura degli anticorpi10 per l'immunocitochimica delle cellule vive con alcune modifiche, come riportato di seguito. Per il test di invasione, viene seguito il protocollo precedentemente descritto da Vinci et al. 201512 .
- Considerare il numero di pozzi (ad esempio, 60 pozzi) per analizzare e calcolare il volume necessario per ciascun reagente. Includere anche i pozzetti per il controllo negativo (campioni con ALR ma senza anticorpi).
- Aggiungere 100 μL di acqua sterile all'ALR per reidratare il reagente (concentrazione finale = 0,5 mg/ml). Pipetta per miscelare la soluzione.
NOTA: Il reagente è sensibile alla luce; Pertanto, tenere al buio. Aliquotare il reattivo residuo e conservare a -80 °C (evitare il congelamento e lo scongelamento). - Mescolare l'anticorpo con l'ALR nel mezzo TSM (o nel mezzo di crescita cellulare appropriato per la linea cellulare scelta) in una piastra multipozzetto a fondo rotondo o in un tubo ambra e proteggere dalla luce.
- Preparare una quantità sufficiente di terreno per erogare 25 μL/pozzetto a una concentrazione finale di 3 volte quella del dosaggio. Incubare a RT per 15 min.
NOTA: Si raccomanda un rapporto molare di 1:3 tra anticorpo e ALR, con una concentrazione finale (1x) dell'anticorpo in esame <1,5 μg/ml. Per gli esperimenti in questo protocollo viene utilizzato un anticorpo di topo CD44 anti-umano (concentrazione iniziale 86 μg/mL) ad una concentrazione finale di 0,1 μg/mL (concentrazione 3x = 0,3 μg/mL). Aggiungere i reagenti nel seguente ordine: i) anticorpo; ii) ALR; iii) Medium TSM. Miscelare mediante pipettaggio. - Diluire il reagente soppressore di fondo (BSR) nel terreno TSM (o nel mezzo di crescita cellulare appropriato per la linea cellulare di scelta) a 1,5 mM (3x) per ottenere alla fine del test una concentrazione finale di 0,5 mM.
- Eseguire il test di invasione direttamente nella piastra di fondo rotondo ULA a 96 pozzetti dove le cellule sono state inizialmente seminate. Controllare visivamente il NS utilizzando un microscopio invertito prima di iniziare.
- Rimuovere delicatamente e lentamente 75 μL/pozzetto del mezzo, evitando di toccare il fondo del pozzetto dove si trova il NS. Verificare visivamente la presenza del NS.
- Aggiungere delicatamente 25 μL di BSR a ciascun pozzetto.
- Aggiungere delicatamente 25 μL del complesso ALR/anticorpo a ciascun pozzetto. Attendere 2 o 3 minuti per lasciare che il complesso ALR/anticorpo si mescoli con il mezzo.
- Controllare visivamente utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che ogni NS sia posizionato centralmente sul fondo del pozzo. Evitare la formazione di bolle. Se è presente una bolla, rimuoverla usando un ago.
- Posizionare il piatto sul ghiaccio e attendere 5 minuti per lasciare che il fondo del piatto si raffreddi.
- Con una punta p200 preraffreddata, erogare 75 μL/pozzetto di matrice a membrana basale (BMM), posizionando la punta della pipetta sulla parete interna del pozzetto ed evitando di toccare il fondo del pozzetto. Evitare la formazione di bolle e rimuovere con un ago sterile quelle esistenti.
NOTA: Assicurarsi di aver scongelato il BMM a 4 °C dalla sera prima. - Lasciare la piastra sul ghiaccio per 5 minuti per lasciare che il BMM si mescoli con il mezzo. Controllare visivamente con un microscopio invertito la presenza dei NS e che siano situati centralmente nel pozzo. In caso contrario, centrifugare la piastra a 4 °C a 180 x g per 5 minuti.
- Trasferire la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive (Table of Materials) posto all'interno dell'incubatore a 37 °C, 5% CO2, 95% umidità.
3. Preparazione del complesso ALR/anticorpo e messa a punto per il saggio di migrazione
NOTA: Per la procedura di etichettatura degli anticorpi, viene utilizzato il protocollo Labeling Dyes10 per l'immunocitochimica delle cellule vive.
- Considerare il numero di pozzi da analizzare e calcolare il volume necessario per ciascun reagente. Includere anche i pozzetti necessari per i controlli negativi. Controllare visivamente il NS utilizzando un microscopio invertito prima di iniziare.
- Utilizzare piastre a fondo piatto da 96 pozzetti. Eseguire la procedura di rivestimento come descritto da Vinci et al., 201314. Per questo studio, il BMM viene utilizzato come rivestimento sottile.
- Una volta che il rivestimento è pronto, rimuovere l'eccesso di rivestimento BMM con una punta p200 posizionando la punta nel bordo del pozzetto ed evitando di toccare il fondo. Se si lavora con più pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale.
- Tagliare una punta p200, prelevare 50 μL del mezzo cellulare + NS da ciascun pozzetto selezionato e trasferirlo in un pozzetto a fondo piatto rivestito. Controllare visivamente la presenza e la posizione del NS in ciascun pozzetto.
NOTA: Ogni NS deve essere posizionato centralmente nel pozzo. Evitare di appoggiarsi alla punta sul bordo del pozzo durante il trasferimento, ma lasciare cadere il mezzo centralmente nel pozzo senza toccare il fondo. Per le celle altamente migratorie, considerare un numero maggiore di repliche rispetto alle tre repliche standard. Questo perché quando NS si trova troppo vicino al bordo del pozzo, le cellule in migrazione possono coprire un'area più piccola del pozzo. - Reidratare l'ALR come descritto sopra (fasi 2.2-2.3).
NOTA: il reagente è sensibile alla luce. Vedi sopra per buone procedure di gestione. - Mescolare l'anticorpo con ALR nell'apposito mezzo di crescita cellulare completo in una piastra multipozzetto a fondo rotondo o in un tubo ambrato e proteggere dalla luce. Preparare una quantità sufficiente per erogare 50 μL/pozzetto a una concentrazione finale di 3 volte quella del test. Incubare a RT per 15 min.
NOTA: Aggiungere i reagenti nell'ordine indicato sopra (punto 2.4). - Seguire la stessa procedura riportata nel passaggio 2.5.
- Aggiungere delicatamente 50 μL di BSR a ciascun pozzetto.
- Aggiungere delicatamente 50 μL di ALR/anticorpo a ciascun pozzetto. Attendere 2 o 3 minuti per lasciare che i reagenti si mescolino e controllare visivamente utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che la maggior parte dei NS replicati si trovino centralmente nel pozzo.
- Evitare la formazione di bolle e rimuovere quelle esistenti utilizzando un ago. Trasferire delicatamente la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive posto all'interno dell'incubatore a 37 °C, 5% CO2, 95% umidità.
4. Impostazione dello strumento di analisi delle cellule vive per l'acquisizione di immagini
- Scansionare le lastre utilizzando lo strumento di analisi delle cellule vive (per le specifiche, vedere la Tabella dei materiali) con intervalli di scansione a partire dal punto di tempo zero (t0) dei saggi di invasione e migrazione impostati, rispettivamente, dopo il passaggio 2.14. e 3.10. fino a 96 h.
NOTA: Assicurarsi di essere in grado di smaltire lo strumento di analisi delle cellule vive immediatamente dopo l'inizio del test di invasione e migrazione. A seconda del tipo di tumore, le cellule possono iniziare a invadere o migrare dal NS già entro 1 ora dalla configurazione del test. - Nel software dello strumento di analisi delle cellule vive, selezionare l'opzione Pianifica acquisizione. Fare clic sulla scheda + e selezionare l'opzione Scansione in programma.
- Nella finestra del software Crea o ripristina nave, fare clic sull'opzione Nuovo.
- Selezionare l'applicazione specifica nello strumento di analisi delle cellule vive per l'acquisizione dell'invasione e della migrazione. Selezionare il tipo di scansione sferoide , l'obiettivo 4x, i canali immagine Phase + Brightfield e Green per il test di invasione. Selezionare il tipo di scansione di clonazione a diluizione , obiettivo 4x e Fase e verde per il test di migrazione.
- Selezionare il tipo di piastra e definire i pozzi da scansionare evidenziandoli sulla mappa della piastra.
- Impostare la frequenza di scansione (per gli esperimenti in questo protocollo la frequenza di scansione era di 15 minuti per l'invasione e 30 minuti per la migrazione).
- Fare clic su Aggiungi a programma e avviare la scansione.
5. Impostazione dello strumento di analisi delle cellule vive per l'analisi delle immagini
- Selezionare la scheda Crea nuova definizione di analisi.
- Selezionare Spheroid Invasion o Basic Analyzer application per invasione e migrazione, rispettivamente, nella scheda.
- Selezionare i canali appropriati per l'invasione e la migrazione (per Invasione: Fase+Campo Luminoso-Verde; per Migrazione: Fase-verde) nel canale immagine.
- Selezionare alcune immagini rappresentative da 3-4 pozzetti per visualizzare in anteprima e perfezionare l'impostazione di analisi.
- Per il saggio di invasione, nella scheda Definizione analisi, regolare le impostazioni dell'applicazione nei canali Brightfield e Green con la seguente impostazione per generare una segmentazione precisa tra le cellule sferoidi intere e invasive (vedere Figura 5; maschera blu):
Segmentazione in campo chiaro: sensibilità sferoide intera = 50; Sensibilità delle cellule invasori = 100; Pulisci = predefinito.
Filtri sferoidi interi: imposta tutti i parametri come predefiniti.
Invading Cells Filters: imposta tutti i parametri come predefiniti.
Segmentazione verde: raggio = 900. - Per il test di migrazione, regolare le impostazioni dell'applicazione nei canali Fase e Verde per generare una segmentazione precisa tra le celle Confluence e Green (vedere la Figura 5, maschere gialle e rosa) con la seguente impostazione:
Fase: imposta tutti i parametri come predefiniti.
Segmentazione verde: raggio = 300; Soglia = 1000
Pulizia: riempimento foro = 400; Filtri = predefinito.
Whole Well: imposta tutti i parametri come predefiniti. - Verificare che le impostazioni di analisi siano corrette per il NS facendo clic in modo casuale su diversi pozzi. La segmentazione deve delineare lo sferoide. In caso contrario, regolare l'impostazione di conseguenza.
- Selezionare i pozzi e i punti temporali da analizzare.
- Salvate la definizione dell'analisi e fate clic su Fine (Finish).
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Representative Results
Il protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive per l'invasione e la migrazione è riassunto in un flusso di lavoro semplice e riproducibile nella Figura 1. Seminando le celle DMG in piastre a fondo tondo ULA a 96 pozzetti, si ottengono NS di dimensioni riproducibili e vengono utilizzate nei passaggi visualizzati. Quando i NS hanno raggiunto la dimensione ideale di ~300 μm (circa 4 giorni dopo la semina) vengono avviati i saggi di invasione12 e migrazione14 . L'aggiunta del complesso ALR/anticorpo insieme al soppressore di fondo nel mezzo del singolo NS, consente di seguire l'espressione specifica del marcatore sulla membrana cellulare, nell'imaging live e nel tempo. L'espressione del marcatore di superficie durante l'invasione e la migrazione cellulare è facilmente monitorabile ad intervalli che vanno da t = 0 fino a 96 h utilizzando lo strumento di analisi delle cellule vive. Questo sistema di imaging consente un'analisi delle immagini completamente automatizzata.
Una linea cellulare primaria derivata dal paziente, QCTB-R059, è stata utilizzata per esemplificare le proprietà di invasione e migrazione della disseminazione del tumore DMG pediatrico. QCTB-R059 è stato originariamente indicato come linea cellulare15 di glioblastoma talamico pediatrico (GBM). Successivamente, è stato indicato come linea cellulare di glioma talamico H3-K27M 16 o glioma diffuso della linea media (DMG) H3-K27M linea cellulare11, a seguito della classificazione 2016 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità dei tumori cerebrali con l'introduzione del DMG H3F3A K27M-mutante come nuova entità17.
CD44, una molecola di adesione nota per essere coinvolta nella migrazione e nell'invasione cellulare, è stata studiata. CD44 è espresso dalle cellule QCTB-R059 come dimostrato da immagini confocali di colorazione immunofluorescente (IF) sulla migrazione delle cellule 3D su (Figura 2) e invasione in (Figura 3) BMM.
Tenendo conto che l'invasione e la migrazione 3D sono entrambi processi non statici, abbiamo pensato di studiare l'espressione di CD44 nel tempo quando le cellule sono in movimento. Per fare questo abbiamo impiegato il saggio di immunocitochimica delle cellule vive e adattato il protocollo per i saggi 3D. Utilizzando l'ALR in complesso con un anticorpo anti-CD44, siamo in grado di seguire in tempo reale l'espressione di CD44 quando la proteina è espressa sulla membrana cellulare mentre le cellule eludono le neurosfere e si diffondono su e nel BMM.
L'immunocitochimica delle cellule 3D vive consente di visualizzare l'espressione di CD44 (Video supplementare 1 e Video supplementare 2). I frame rappresentativi del time-lapse, sia per la migrazione che per l'invasione (Figura 4A,B), mostrano più in dettaglio l'espressione intermittente di CD44 sulla membrana cellulare. In particolare, è possibile vedere il segnale fluorescente verde essere acceso (cerchio verde) e poi spento (cerchio nero) sulla stessa cellula osservata nel tempo, suggerendo che l'espressione di CD44 è accesa e spenta mentre le cellule migrano e invadono.
I processi di migrazione e invasione sono seguiti nell'arco di 96 ore e, come mostrato in Figura 5, le cellule QCTB-R059 mostrano un alto livello di CD44, dimostrando che nel complesso l'espressione osservata con l'immunocitochimica delle cellule vive è in linea con l'espressione di CD44 ottenuta da IF mostrata sulle immagini confocali in Figura 2 e Figura 3. È interessante notare, tuttavia, che quando l'anticorpo anti-CD44 viene utilizzato su cellule vive, influisce sulla morfologia cellulare, inducendo una transizione dall'invasione mesenchimale a quella ameboide. Induce una riduzione della capacità invasiva e migratoria di queste cellule (Figura supplementare 1). Non possiamo escludere, tuttavia, che la riduzione della migrazione cellulare e dell'invasione osservata sia anche in parte dovuta a un'inibizione della proliferazione cellulare.
L'analisi automatizzata delle immagini eseguita sullo strumento di analisi delle cellule vive mostra la quantificazione dell'espressione di CD44 e il suo aumento nel tempo, misurato dal segnale fluorescente verde complessivo associato all'ALR (Figura 5B,C) sia per la migrazione che per l'invasione. Le quantificazioni sono ottenute come esemplificato nella Figura 5B e nella Figura 5C, con l'analisi automatizzata delle immagini impostata per segmentare tutta l'area coperta dalle cellule CD44 a migrazione verde (Figura 4B) e tutta l'area di diffusione coperta dalle cellule CD44 invase dal verde ma escludendo il nucleo della neurosfera (Figura 5C).
Figura 1: Flusso di lavoro schematico dei saggi di immunocitochimica delle cellule 3D vive. Il flusso di lavoro mostra le fasi coinvolte nell'invasione 3D e nei metodi di imaging live di migrazione, comprese le immagini rappresentative delle cellule pediatriche derivate dal paziente DMG primario (QCTB-R059) dopo l'invasione in (pannello superiore; t = 96 h) e la migrazione su (pannello inferiore; t = 96 h) BMM. Barre = 800 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Espressione di CD44 nella migrazione delle cellule tumorali 3D. Immagini confocali immunofluorescenti rappresentative dell'espressione di CD44 in cellule derivate da pazienti DMG primari (QCTB-R059) dopo migrazione su BMM. Timepoint = 96 h (rosso:CD44; blu: nuclei). Barre della scala: 500 μm (pannello superiore) e 200 μm (pannello inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Espressione di CD44 nell'invasione delle cellule tumorali 3D. Immagini confocali immunofluorescenti rappresentative dell'espressione di CD44 in cellule derivate da pazienti DMG primari (QCTB-R059) dopo invasione nel BMM. Punto temporale = 96 h (rosso:CD44; blu: nuclei). Barre di scala: 250 μm (pannello superiore) e 100 μm (pannello inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Espressione di CD44 nel tempo. Fotogrammi selezionati del time-lapse di migrazione (A) e invasione (B) QCTB-R059. Le immagini sono state ottenute sullo strumento di imaging delle cellule vive. Il cerchio verde indica l'espressione di CD44, il cerchio nero indica che non c'è espressione di CD44 sulla membrana cellulare della stessa cellula osservata nel tempo. Barre scala: 200 μm (A) e 100 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D vive per CD44: migrazione e invasione. (A) Vengono mostrate immagini rappresentative in campo chiaro, fluorescenti (ALR con anticorpo anti-CD44) e di fusione della migrazione e dell'invasione dell'immunocitochimica cellulare QCTB-R059 (96 ore). Barre di scala: 400 μm. (B) Quantificazione dell'espressione complessiva di CD44 relativamente alla migrazione (B) e all'invasione (C), determinata mediante analisi dell'immagine ALR-anti-CD44 sullo strumento di imaging delle cellule vive. Le curve mostrano l'intensità media verde dell'espressione di CD44 nel tempo. I valori sono medi ± SD. Le due piccole figure nei grafici mostrano la segmentazione applicata per l'analisi della migrazione (B) in cui è stata considerata tutta l'area e l'invasione (C) per la quale è stata esclusa la parte centrale NS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Effetto dell'anticorpo anti-CD44 sulla morfologia cellulare e sul grado di motilità cellulare. Immagini rappresentative del saggio di invasione e migrazione QCTB-R059 mostrano l'effetto dell'anticorpo anti-CD44 utilizzato per l'immunocitochimica delle cellule 3D vive. Le cellule mostrano una ridotta capacità di invasione e migrazione, nonché la transizione da un modello di invasione più mesenchimale a quello ameboide tra il controllo negativo (senza anticorpo anti-CD44) e CD44 (più anticorpo anti-CD44). Il pannello inferiore mostra un maggiore ingrandimento di potenza che mostra una visione più chiara dell'aspetto morfologico delle cellule in assenza e della presenza dell'anticorpo anti-CD44 (frecce bianche). Barre di scala: pannello superiore da 800 μm e pannello inferiore da 100 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Video supplementare 1: Video time-lapse della migrazione cellulare 3D QCTB-R059 su BMM in presenza di anticorpi anti-CD44. Il segnale verde fluorescente, che rappresenta l'espressione di CD44 sulla membrana cellulare, viene visualizzato nel tempo dalla coniugazione dell'anticorpo anti-CD44 con ALR. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Video time-lapse dell'invasione cellulare 3D QCTB-R059 in BMM in presenza di anticorpi anti-CD44. Il segnale verde fluorescente, che rappresenta l'espressione di CD44 sulla membrana cellulare, viene visualizzato nel tempo dalla coniugazione dell'anticorpo anti-CD44 con ALR. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
L'immunocitochimica delle cellule 3D vive che abbiamo adottato qui per l'invasione e la migrazione del DMG pediatrico potrebbe essere facilmente adattata anche per altri tipi di cellule tumorali altamente invasive, comprese le linee cellulari di cancro al seno e al colon.
A differenza dei saggi di immunocitochimica delle cellule 2D vive precedentemente eseguiti10, quando si lavora in 3D, si suggerisce di prestare attenzione ad alcuni passaggi critici. In particolare, per il saggio di invasione che descriviamo, si consiglia di aggiungere la miscela ALR/anticorpo direttamente al mezzo con NS in ciascun pozzetto, prima dell'aggiunta del BMM, e non nel BMM o sopra il BMM una volta gelificato. Questo per consentire un buon mix dei reagenti con il mezzo e garantire un accesso più diretto dei reagenti alla superficie cellulare. Inoltre, per garantire una migliore qualità dell'imaging, sebbene il protocollo preveda l'uso del BSR, consigliamo di utilizzare il mezzo privo di rosso fenolo e BMM.
Un altro punto da considerare per l'immunocitochimica delle cellule vive è che qualsiasi anticorpo che lega una proteina di membrana extracellulare su cellule vive può influenzare la funzione della proteina alterandone la conformazione o occupando il sito di legame di un ligando o di una proteina su una cellula adiacente, agendo quindi come "agente bloccante"18,19. Mentre questo approccio può essere utile come strategia terapeutica19, potrebbe non essere l'obiettivo primario di qualsiasi configurazione sperimentale. Pertanto, prima di eseguire una vasta serie di esperimenti, diversi anticorpi che legano epitopi distinti della stessa proteina dovrebbero essere testati per verificare anche qualsiasi potenziale effetto di "blocco". In questo studio, abbiamo utilizzato un anticorpo specifico per seguire in tempo reale l'espressione di CD44 sulla membrana cellulare di una linea cellulare DMG pediatrica altamente aggressiva nell'invasione e migrazione 3D. Il protocollo utilizzato ci ha permesso di misurare quantitativamente l'espressione di CD44 nel tempo sulle cellule invasive e migratorie. È interessante notare che, in presenza dell'anticorpo anti-CD44, abbiamo anche notato una riduzione della motilità cellulare rispetto alle cellule con ALR ma in assenza dell'anticorpo. Non possiamo escludere però anche un effetto inibitorio sulla proliferazione cellulare. L'acquisizione di un diverso modello di invasione con un passaggio dalla morfologia cellulare mesenchimale a quella ameboide20 è stata osservata anche in presenza di anticorpi anti-CD44. Questi risultati inaspettati suggeriscono che il blocco di CD44 può contribuire alla transizione da mesenchimale ad ameboide nel DMG pediatrico.
Per quanto riguarda i limiti di questo protocollo, prendendo in considerazione la risoluzione della camera CCD dello strumento di analisi delle cellule vive Incucyte e la sua limitata capacità z-stack, la configurazione che presentiamo per i saggi di immunocitochimica delle cellule 3D vive può essere utilizzata come approccio preliminare, su un formato multi-pozzetto su larga scala, prima di passare a un'analisi più approfondita utilizzando sistemi di imaging fluorescente più potenti (ad esempio, microscopi confocali e sistemi di imaging ad alto contenuto con modalità confocale come l'Operetta CLS o l'Opera Phoneix) o un approccio più raffinato per studiare in tempo reale l'espressione di una proteina di superficie tramite un reporter assay21.
Un'applicazione più ampia dell'immunocitochimica delle cellule 3D vive presentata qui come monocoltura, potrebbe essere un saggio di co-coltura 3D stabilito per visualizzare e analizzare in tempo reale le interazioni cellula-cellula diretta. In questo caso, due diversi ALR potrebbero essere utilizzati con diversi fluorofori per legare proteine specificamente espresse sulla membrana cellulare su diversi tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali e cellule immunitarie). In questo caso, il contatto diretto cellula-cellula può essere analizzato con live imaging mediante la co-localizzazione dei due diversi complessi ALR/anticorpi.
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Disclosures
Gli autori non hanno affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o entità con un interesse finanziario o un conflitto finanziario con l'argomento o i materiali discussi nel manoscritto.
Acknowledgments
Si ringraziano la Dott.ssa Silvia Soddu e la Dott.ssa Giulia Federici (Unità di Reti Cellulari e Bersagli Terapeutici Molecolari, IRCCS-Istituto Nazionale Tumori Regina Elena, Roma, Italia) per l'accesso al sistema di imaging IncuCyte S3 Live Cell nell'impostazione preliminare del protocollo di imaging. Inoltre, ringraziamo Bernadett Kolozsvari per la consulenza tecnica. Lo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione Children with Cancer UK (16-234) e dal Ministero della Salute italiano Ricerca Corrente. M Vinci è un Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti è vincitore della Fondazione Veronesi Fellowship (2018 e 2019). Gli autori riconoscono Fondazione Heal per il loro sostegno e la Children's Hospital Foundation per il finanziamento della Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
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