Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri
Summary
Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.
Abstract
Hücre göçü ve invazyonu, Diffüz Orta Hat Gliomu (DMG) H3K27M mutant tümörlerinin ayırt edici özellikleridir. Bu özellikleri, üç boyutlu (3D) hücre tabanlı invazyon ve migrasyon tahlilleri kullanarak zaten modelledik. Bu çalışmada, bu 3D tahlilleri canlı hücre immünositokimyası için optimize ettik. Bir DMG H3K27M primer hasta kaynaklı hücre hattının göç eden ve istilacı hücrelerinin plazma membranı üzerindeki adezyon molekülü CD44’ün ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için bir Antikor Etiketleme Reaktifi kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkilidir ve merkezi sinir sistemi (CNS) hücre dışı matrisi ile doğrudan etkileşimlerde rol oynar. DMG H3K27M hücre hattından nörosferler (NS), bazal membran matrisine (BMM) gömüldü veya antikor etiketleme reaktifi (ALR) ile birlikte bir anti-CD44 antikoru varlığında ince bir BMM kaplama tabakasına yerleştirildi. Canlı 3D hücre immünositokimya görüntü analizi, özellikle göç eden ve istilacı hücreler üzerinde genel CD44 ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek için bir canlı hücre analiz cihazında gerçekleştirildi. Yöntem ayrıca, göç eden ve istilacı hücrelerin plazma zarı üzerindeki CD44’ün aralıklı ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, test, CD44’ün DMG H3K27M hücrelerinde mezenkimal – amipoid geçişindeki potansiyel rolü hakkında yeni bilgiler sağladı.
Introduction
Tümör hücrelerinin çevre dokudan kaçma ve yayılma yeteneği, kanserin ayırt edici özelliğidir1. Özellikle, tümör hücresi motilitesi, meme2 veya kolorektal kanser3 gibi metastatik bir tümör tipi veya diffüz glioma4,5 gibi lokal olarak invaziv bir tip olsun, malign tümörlerin karakteristik bir özelliğidir.
Görüntüleme, tümör hücresi fenotiplerinin birçok yönünün araştırılmasında merkezi bir role sahiptir; Bununla birlikte, göç ve invazyon gibi dinamik hücresel süreçleri incelerken, morfoloji ve hücre-hücre etkileşiminde 6,7 değişiklikler meydana geldiğinde ve zaman içinde daha kolay incelenebildiğinde, canlı hücre görüntüleme kesinlikle tercih edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme için, faz kontrastından konfokal floresan mikroskoplara kadar farklı optik mikroskopi sistemleri kullanılabilir ve sıcaklık veCO2 kontrolü için bir hazne ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopta kısa veya uzun bir süre boyunca gerçekleştirilen görüntü elde etme veya yerleşik odalara sahip yüksek içerikli görüntü analiz sistemlerinde veya alternatif olarak tüm süre boyunca hücreleri rahatsız etmeye gerek kalmadan inkübatörde oturabilen görüntü sistemlerinde deneyin. Kullanılan sistemin seçimi genellikle ihtiyaç duyulan çözünürlük, genel alım süresinin uzunluğu ve zaman aralıkları, kullanılan kap tipi ve testin verimi (tek odacıklı veya çok kuyulu plaka), kullanılan hücrelerin duyarlılığı (değerli ve/veya nadir hücreler) ve floroforlar varsa hücrelerin fototoksisitesi gibi bir dizi faktör tarafından belirlenir.
Canlı modda floresan görüntüleme ile ilgili olarak, bu, floresan proteinlerin ekspresyonu için hücrelerin kararlı ekspresyon veya indüklenebilir bir sistem8 olarak, geçici hücre transfeksiyonu ile transdüksiyonu veya şu anda canlı hücre etiketlemesi7, canlı hücre takibi ve hücre altı organelleri etiketleme9 için mevcut olan hücre boyaları kullanılarak elde edilebilir.
Son zamanlarda, seçilen bir yüzey markörünü tanıyan bir antikorun bir etiketleme reaktifine bağlanabildiği ve kültür ortamına eklendikten sonra, spesifik markörü eksprese eden hücrelerin canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak kolayca görüntülenebildiği canlı hücre immünositokimyası için yararlı bir yaklaşım geliştirilmiştir. Böyle bir sistem kullanılarak işaretleyici ekspresyonunun görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi, hücreler iki boyutlu (2D) kültür koşullarında büyütüldüğünde kolayca elde edilebilir10.
Bu çalışmada, pediatrik diffüz orta hat glioma (DMG) hasta kaynaklı hücrelerin canlı 3D hücre immünositokimya invazyonu ve migrasyonu için protokolleri optimize ettik11,12. DMG, çocukları etkileyen oldukça agresif beyin tümörleridir ve büyük çoğunluğu histon H3 varyantlarındaki sürücü mutasyonu K27M ile ilişkilidir. DMG, beyin sapında ve merkezi sinir sisteminin (MSS) orta hat bölgelerinde ortaya çıkar ve oldukça infiltratif bir yapıya sahiptir. Bu invaziv kapasitenin en azından kısmen intratümör heterojenliği ve DMG hücrelerinin kanser kökü benzeri özellikleri tarafından aracılık edildiği gösterilmiştir7.
Testlerimizi örneklemek için, CD44 için bir antikor ile kombinasyon halinde bir antikor etiketleme reaktifi (ALR) kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkili, kök hücre ve diğer hücre tipleri üzerinde eksprese edilen bir transmembran glikoprotein ve adezyon molekülüdür13. Protokoller arasında numune hazırlama, parlak alan ve floresan modunda görüntü elde etme ve 3D invazyon ve göç sırasında DMG hücre zarı üzerindeki genel CD44 ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak nicel olarak ölçülmesine izin veren bir canlı hücre analiz cihazında analiz yer alır. Tahliller ayrıca, göç ederken ve istila ederken CD44’ün aralıklı floresan sinyalini tek tek hücreler üzerinde görselleştirme olanağına da izin verdi. İlginç bir şekilde, potansiyel olarak bloke edici bir antikor olarak hareket eden anti-CD44 antikorunun bir etkisi de gözlendi, aynı zamanda hücre göçünü ve invazyonunu azalttığı ve ayrıca invazyon modelinin kolektif mezenkimal benzeri bir fenotipten daha tek hücreli amip benzeri bir fenotipe geçişini indüklediği görüldü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada pediatrik DMG invazyonu ve göçü için benimsediğimiz canlı 3D hücre immünositokimyası, meme ve kolon kanseri hücre hatları dahil olmak üzere diğer yüksek invaziv tümör hücre tipleri için de kolayca uyarlanabilir.
Daha önce gerçekleştirilen canlı 2D hücre immünositokimya testlerinden farklı olarak,3D olarak çalışırken, bazı kritik adımlara dikkat edilmesi önerilir. Özellikle, tarif ettiğimiz invazyon testi için, ALR/antikor karı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Silvia Soddu ve Dr. Giulia Federici’ye (Hücresel Ağlar ve Moleküler Terapötik Hedefler Birimi, IRCCS-Regina Elena Ulusal Kanser Enstitüsü, Roma, İtalya) görüntüleme protokolünün ön kurulumunda IncuCyte S3 Canlı Hücre Görüntüleme Sistemine erişim için teşekkür ederiz. Ayrıca, teknik tavsiyeleri için Bernadett Kolozsvari’ye teşekkür ederiz. Çalışma, Kanserli Çocuklar İngiltere hibesi (16-234) ve İtalya Sağlık Bakanlığı Ricerca Corrente tarafından desteklenmiştir. M Vinci, Kanserli Çocuklar İngiltere Üyesidir. R Ferretti, Fondazione Veronesi Bursu (2018 ve 2019) sahibidir. Yazarlar, destekleri için Fondazione Heal’e ve Queensland Çocuk Tümör Bankası’nı finanse ettiği için Çocuk Hastanesi Vakfı’na teşekkür eder.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
