Hagle proteomics prøvebehandling automatisert av en åpen kildekode lab robot
Summary
Detaljert protokoll og tre Python-skript er gitt for å betjene et åpen kildekode robotisert væskehåndteringssystem for å utføre halvautomatisk proteinprøvepreparering for massespektrometriforsøk, som dekker fjerning av vaskemiddel, protein fordøyelse og peptidavsaltingstrinn.
Abstract
Massespektrometribaserte hagleproteomiske eksperimenter krever flere prøveprepareringstrinn, inkludert enzymatisk proteinfordøyetid og opprydding, som kan ta opp betydelige persontimer med benkarbeid og presentere en kilde til batch-til-batch-variasjon. Laboratorieautomatisering med pipetteringsroboter kan redusere manuelt arbeid, maksimere gjennomstrømningen og øke forskningens reproduserbarhet. Likevel gjør de bratte startprisene på standard automatiseringsstasjoner dem uoverkommelige for mange akademiske laboratorier. Denne artikkelen beskriver en arbeidsflyt for proteomikkprøveforberedelse ved hjelp av et rimelig automatiseringssystem med åpen kildekode (Opentrons OT-2), inkludert instruksjoner for å sette opp halvautomatisk proteinreduksjon, alkylering, fordøyelse og oppryddingstrinn; i tillegg til å følge open source Python-skript for å programmere OT-2-systemet gjennom applikasjonsprogrammeringsgrensesnittet.
Introduction
Massespektrometribasert hagleproteomikk er et kraftig verktøy for å måle overflod av mange proteiner i biologiske prøver samtidig. Proteomiske eksperimenter med bioinformatikkanalyse brukes rutinemessig til å identifisere biomarkører og oppdage tilhørende biologiske komplekser og veier som ligger til grunn for patologiske mekanismer. Med sin høye analyttspifisitet og potensielle kvantitative nøyaktighet har hagleproteomikk også utmerket potensial til å bli vedtatt av forskningsfasiliteter og diagnostiske laboratorier for klinisk prøveanalyse uten å måtte stole på antistoffer1,2.
For å forberede proteinprøver for hagleproteomikkanalyse, må proteiner som ekstraheres fra biologiske prøver (f.eks. celler og vev) vanligvis først behandles ved hjelp av lange protokoller, inkludert måling av prøveproteinkonsentrasjon, proteinreduksjon og alkylering og enzymatisk fordøyelse i peptider. Videre krever proteiner ekstrahert i vanlige lysisbuffere som inneholder vaskemidler ofte ytterligere trinn for bufferutveksling eller fjerning av vaskemiddel før analyse fordi vaskemiddel kan forstyrre trypsin fordøyelsen og betydelig forringe ytelsen til nedstrøms væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse3. Peptider blir vanligvis ytterligere desalted, tørket og rekonstituert i LC-MS/MS-kompatible løsningsmidler etter enzymatisk fordøyelse. Disse proteinbiokjemiprosedyrene kan være arbeidskrevende og tidkrevende. Dermed fortsetter de å begrense gjennomstrømningen av proteomiske arbeidsflyter og bidra til variasjonen av innsamlede data4,5. Menneskelige feil og skjevheter har blitt anerkjent som avgjørende faktorer som påvirker datavariasjon og reproduserbarhet6,7. For å minimere menneskelige feil i arbeidsflyter for prøvepreparering av massespektrometri, har automatiserte pipetteringsrobotsystemer blitt brukt til å forbedre gjennomstrømningen og reproduserbarheten av proteinidentifikasjon og kvantifisering fra hagleproteomikk og målrettet massespektrometrianalyse, der slike fremskritt har blitt hyllet som avgjørende for å fortsette presset for utbredt bruk av proteomikkteknologier i kritisk forskning og kliniske innstillinger8, 9,10,11,12,13. Imidlertid bruker de fleste eksisterende protokoller robotiserte væskehåndteringsplattformer som krever betydelige investeringer og opplæring, begrenser deres nytte i mange laboratorier i fagmiljøet eller på annen måte med et begrenset budsjett.
Denne artikkelen beskriver en protokoll som bruker et rimelig robotbasert væskehåndteringssystem med åpen kildekode, OT-2, for å halvautomatere en typisk arbeidsflyt for klargjøring av hagleproteomikk. OT-2 har en lavere kostnad enn mange andre robotiserte væskehåndteringssystemer, og koster i skrivende stund omtrent $ 5,000 amerikanske dollar. Når du tar hensyn til prisene på forskjellige moduler og labware, er den totale kostnaden for å sette opp eksperimenter i denne protokollen i skrivende stund rundt $ 10,000, noe som gjør det rimeligere for et betydelig bredere sett med laboratorier over dyrere alternativer. OT-2 er kompatibel med åpen kildekode-programmering gjennom Python-skript og gir stor fleksibilitet i brukerdefinert DIY-protokolldesign. Ved hjelp av tre interne utviklede skript, protokollene nedenfor dekke utføre en typisk hagle proteomics prøve forberedelse arbeidsflyt på OT-2 stasjonen med en arketypisk protein standard (bovine serum albumin; BSA) og en kompleks proteinprøve av et normalt menneskehjertelys (figur 1). Prosedyrene for behandling (1) en BSA-prøve og (2) en kompleks hjertelysprøve er beskrevet i protokolldelene henholdsvis 1, 2, 5, 6 og 3, 4, 5, 6. Sera-Mag karboksylatmodifiserte magnetiske perler brukes i en-pot solid-fase-forbedret prøvepreparering (SP3) for å fjerne vaskemidler og salter i protein- og peptidprøvene. Tryptiske fordøyer fra bovint serumalbumin og humane hjerteproteiner rengjøres ytterligere av SP3-perler og sendes inn for LC-MS /MS-analyse. Massespektra analyseres deretter ved hjelp av MaxQuant-programvaren for peptid og proteinidentifikasjon. Representative resultater utført av oss viser at protokollen oppnår gode tekniske variasjonskoeffisienter (CV) samtidig som benktiden spares og ikke er dårligere enn håndfordøyd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
For best ytelse bør Opentrons-verifisert labware, moduler og forbruksvarer som er kompatible med OT-2 brukes. Tilpasset labware kan opprettes etter Opentrons instruksjon på Reference14. Sørg for å kalibrere OT-2-decket, pipettene og labware når de brukes for første gang. Det er også viktig å følge retningslinjer fra SP3 perler produsent for å forberede perler for peptid og protein opprydding. Spesielt under perle- og peptidbindingsreaksjon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH-priser F32-HL149191 til YH; R00-HL144829 til EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 til MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 er opprettet ved hjelp av et nettbasert vitenskapsillustrasjonsverktøy, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
